Remerciements
1. Liste des abréviations
2. Introduction et objectifs
3. Rappel bibliographique
3.1. Morphine et ses dérivés
3.2. Récepteurs aux opiacés
3.3. Opiacés endogènes
3.4. Addiction aux opiacés
3.5. Mécanismes moléculaires de la dépendance et de la tolérance
3.5.1. Dépendance
3.5.2. Tolérance
3.5.3 GRKs et arrestines
3.5.3.1 Protéines régulatrices et opiacés
3.5.4. Régulation homologue des récepteurs aux opiacés
3.5.5. Régulation hétérologue des récepteurs aux opiacés
3.5.6. MAPKS (mitogen activated protein kinases)
3.5.6.1. ERKs (extracellular signal-regulated kinases) et opiacés
3.6. Plasticite neuronale
3.7. Neurofilaments (NFs)
3.7.1. Structure des NFs
3.7.2. Croissance et transport axonaux
3.7.2.1. Croissance axonale et NFs
3.7.2.2. Transport axonal
3.7.3. Assemblage des NFs
3.7.3.1. Dimère
3.7.3.3. Oligomère
3.7.4. Phosphorylation des NFs
3.7.4.1. Cdk5 (cyclin dependent kinases 5) et NFs
3.7.4.2. MAPK et NFs
3.7.5. Phosphatases régulant la phosphorylation de NFs
3.7.6. Pathologies
3.7.6.1. Maladies des motoneurones
3.7.6.2. Maladies neurodégénératives
3.7.6.3. Neuropathies produites par des neurotoxines
3.7.6.4. Modulation des NFs dans l'addiction aux opiacés
4. Matériels et méthodes
4.1. Appareils
4.2. Réactifs
4.3. Anticorps
4.4. Sélection des cerveaux humains (contrôles et addicts aux opiacés)
4.5. Animaux
4.5.1 Traitement des rats avec de la morphine et de l'héroïne
4.5.2 Traitement des souris avec de la morphine
4.6. Préparation d'homogénat total de cortex préfrontal humain et de cortex cérébral de souris
4.6.1. Homogénéité des préparations de cortex préfrontal humain
4.7. Préparation des protéines membranaires de cortex cérébral de rats
4.8. Etude du délai post-mortem (pmd) et de l'âge dans le cerveau humain
4.9. Préparation de neurofilaments (nfs) purifiés
4.10. Déphosphorylation des nfs phosphoryles avec la réaction à la phosphatase alcaline
4.11. Culture cellulaire
4.11.1 Traitement des cellules SH-SY5Y avec de la morphine
4.11.2 Inhibition de l'activité d'ERK1/2 avec l'inhibiteur PD98059
4.12. Obtention d'un culot cellulaire pour l'électrophorèse
4.13. Quantification des protéines
4.14. Electrophorèse (SDS-PAGE)
4.15. Coloration des gels
4.16. Transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose
4.17. Immunodétection des protéines
4.18. Quantification des protéines par densitométrie
4.19. Linéarité de la concentration des protéines pour le western blotting
4.20. Statistique
5. Résultats
5.1. Etudes du cerveau humain post-mortem
5.1.1. Statut du récépteur
m
-opioïde dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.1.1.1. Caractéristiques de l'antisérum Mu/2EL
5.1.1.2. Effet du PMD et de l'âge sur l'immunoréactivité du récepteur
m
5.1.1.3. Densité du récepteur
m
dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.1.2. Régulation du récepteur
m
-opioïde par les protéines GRKs et
b
-arrestin2 dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.1.2.1. Caractéristiques des anticorps utilisés pour l'immunodétection des kinases GRKs et de la protéine
b
-arrestin2 dans le cerveau humain
5.1.2.2. Effet du PMD et de l'âge sur l'immunoréactivité des kinases GRKs et de la protéine
b
-arrestin2
5.1.2.3. Densité des protéines régulatrices du récepteur
m
dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.1.2.4. Relation entre le récepteur
m
-opioïde et les protéines impliquées dans la régulation homologue du récepteur
5.1.3. Statut de la voie de l'AMPc dans le cerveau d'addicts aux opiacés
5.1.3.1. Caractérisation des anticorps utilisés pour l'immunodétection des protéines appartenant à la voie de l'AMPc
5.1.3.2. Effet du PMD et de l'âge sur les protéines cibles de la voie de l'AMPc
5.1.3.3. Densité des protéines PKA, tCREB et pCREB dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.1.3.4. Relation entre PKA et CREB
5.1.4. Etat de la voie des MAPKs dans le cerveau d'addicts aux opiacés
5.1.4.1. Caractérisation des anticorps pour l'identification dans le cerveau humain des protéines appartenant à la voie de MAPKs
5.1.4.2. Effet du PMD et de l'âge sur les protéines appartenant à la voie des MAPKs
5.1.4.3. Densité des protéines de la voie des MAPKs dans le cerveau d'addicts aux opiacés
5.1.5. Etude de la modulation des neurofilaments dans le cerveau d'addicts aux opiacés
5.1.5.1 Caractérisation des anticorps spécifiques des différentes sous-unités de NFs
5.1.5.2. Effet du PMD et de l'âge sur les NFs dans le cerveau humain
5.1.5.3. Taux des formes non-phosphorylées de NFs dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.1.5.4. Densité de NFs phosphorylés et de la phosphatase PP2A dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.1.5.5. Densité de GFAP dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.1.6. Régulation du complexe p35/cdk5 dans les cerveaux d'addicts aux opiacés : relation avec les neurofilaments
5.1.6.1. Caractérisation des anticorps pour la détermination des densités des protéines p35 et cdk5 dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.1.6.2. Effet du PMD et de l'âge sur p35 et cdk5 dans le cerveau humain
5.1.6.3. Densité de p35, de cdk5 et de NF-H dans les cerveaux d'addicts aux opiacés
5.2. Etudes dans les cerveaux de rats et de souris
5.2.1. Effet de la morphine sur la phosphorylation de NF-H dans le cerveau de rats
5.2.1.1. Caractérisation des anticorps pour l'immunodétection des NFs dans les cerveaux des rats
5.2.1.2. Effet des traitements chroniques et aigus de morphine et de naloxone sur les protéines NF-H phosphorylée et NF-L dans les cerveaux des rats
5.2.2. Spécificité de l'effet de la morphine sur les NFs : souris knockout pour le recepteur
m
-opioïde
5.2.2.1. Caractérisation des anticorps utilisés pour la détermination de la spécificité de l'effet de la morphine sur les souris KO pour le récepteur
m
5.2.2.2. Détermination des taux de NF-H phosphorylé et de NF-L dans les cerveaux de souris WT et de souris KO pour le récepteur
m
. Effet de la morphine
5.2.3. Effet de la morphine sur la voie des MAPKs dans le cerveau des rats
5.2.4. Effet de la morphine sur le complexe p35/Cdk5 dans le cerveau des rats
5.3. Modulation de la phosphorylation de NF-H et de la voie des MAPKs par les opiacés dans la lignée cellulaire SH-SY5Y
5.3.1. Caractéristiques des anticorps utilisés pour la détermination des kinases ERK1/2 et de NFs
5.3.2. Estimation de la réponse d'ERK1/2 et de NF-H à la morphine
5.3.3. Spécificité de l'effet de la morphine sur la kinase ERK au travers de la voie des MAPKs dans les cellules SH-SY5Y
5.3.4. Relation entre l'activation de ERK1/2 et la phosphorylation de NF-H
6. Discussion
7. Conclusions générales
8. Bibliographie
9. Liste de publications