Remerciements
Résumé
1. Introduction
1.1. But
1.2. Généralités
1.3. Etat actuel des connaissances
A) Vitesse de refroidissement
B) Cryoprotectants
2. Revue de la littérature et rappel théorique
2.1. Isolement cellulaire
2.2. Culture d'hepatocytes
A) Culture en suspension
B) Culture standard
C) Culture avec milieux spéciaux
D) Co-culture
E) Culture mono couche sur substrat organique
F) Culture tridimensionnelle
2.3. Cryopréservation
A) Généralités sur la cryopréservation
1) Principes fondamentaux
B) Congélation des cellules
1) L'eau intracellulaire durant la congélation
2) Cinétique du transport de l'eau
3) Effet de la formation de glace intracellulaire sur la survie cellulaire
4) Comportement du gel artificiel lors de la cryopréservation
C) Réchauffement des cellules
3. Matériel et méthode
3.1. Protocole d'isolement des hépatocytes
3.2. Protocole de culture simple d'hépatocytes
3.3. Protocole pour les cultures d'hépatocytes en sandwich par double couche de collagène
3.4. Protocole de cryopréservation des hépatocytes en suspension
3.5. Protocole de cryopréservation des hépatocytes en culture sandwich
3.6. Protocole de réchauffement des hépatocytes
3.7. Protocole des tests de contrôles
A) Quantitatif :
FACS
B) Qualitatif : Réponse hépatocytaire à une stimulation par IL-6
1) Méthode de culture pour ELISA
2) Dosage du fibrinogene de rat dans le surnageant
2.1) Conjugaison de l'anticorps anti-fibrinogène
2.2) Test ELISA
C) Morphologique
1) Etude en microscopie confocale
2) Coloration à la Carboxy-Fluorescéine di-acétate (CFDA)
4. Résultats
4.1. Isolement d'hépatocytes
4.2. Cultures tridimensionnelles
A) Etude du cytosquelette
B) Coloration à la Carboxy-Fluoresceine di-acétate (CFDA)
4.3. Cryopréservation
A) Détermination de la courbe de température de refroidissement
B) Détermination de la concentration de DMSO
4.4. ELISA
A) Synthèse de fibrinogène après cryopréservation
5. Discussion
5.1. Isolement cellulaire
5.2. Cultures tridimensionnelles
5.3. Cryopréservation
4.4. Evaluation fonctionnelle
6. Conclusion
Bibliographie
Note(s)