UNIVERSITÉ DE GENÈVE

FACULTÉ DE MÉDECINE

Département de Medecine Interne,
Division d'angiologie et d'hémostase,
Unité d'hémostase

L'effet des statines sur l'activation des cellules endothéliales par les anticorps antiphospholipides

Thèse
présentée à la Faculté de Médecine de l'Université de Genève
pour obtenir le grade de Docteur en Médecine

par

Yordanka DIMITROVA-TIREFORT

(de Bulgarie)

sous la direction du
Pr Philippe de Moerloose

Thèse n° Méd. 10344

Genève, 2003


      I wish to express my sincere and profound gratitude to Professor Philippe de Moerloose who gave me the opportunity to do my thesis and, by his support, competences, and impressive enthusiasm, ensured the realisation of this study. I particularly thank him for his patience and belief in this work and in me during these years. His fascinating professionalism created in me the scientific vision for the medecine.

      I also owe my deep gratitude to Dr Egbert Kruithof for the work under his guidance. His enormous knowledge about the methods of cellular biology and science in general has greatly helped this study to succeed. I wish to thank him for his continued support during this project being always there in good and in bad days.

      In spite of their own busy schedules Professor Philippe de Moerloose and Dr Egbert Kruithof gave me invaluable guidelines during the preparation of my manuscript and reviewed it in a short time which helped me to accomplish this study.

      Grateful acknowledgements to Dr Sylvie Dunoyer-Geindre for her cooperation, indispensable help and assistance in cell culture preparations and all the technics I learned durind last two years.

      Special thanks are also due to Dr Guido Reber for his collaboration and carrying out the statistical analysis of my data as well as for introducing me to the laboratory diagnosis of antiphospholipid syndrome.

      I am sincerely grateful to Dr Natalie Satta-Poschung and Dr Jia Wei Liu for the effective coordination of needs, for giving me many valuable tips and for the time devoted trying to solve the problems. Many thanks also to Hong Yang for her assistance and friendship and to Richard Fish for his helpful suggestions.

      Sincere thanks to Dr Françoise Boehlen who kindly provided all patients' sera, as well as to Dr François Mach and Dr Brenda Kwak, Division of Cardiology, University Hospital of Geneva, for for providing the human saphenous vein endothelial cells and all statins I used in this study.

      I also thank to Dominique Wohlwend and Susanne Bissat for their competentence and knowledge on the flow cytometry analysis and FACSSCAN.

      I am very thankful to Professor H. Bounameaux who accepted me in the Division of Angiology and Hemostasis, as well as to Isabelle de Haller for her competence and availability for arranging all the administrative part of my stay.

      I wish to thank all the people from Division of Angiology and Haemostasis for their interest in my work. In particular, my heartfelt thanks to Philippe Minazio, Oana Bulla, Christiane Wyler, Yen Lai-Chu, Catherine Vifian and Dominique Attias for the warm welcome, kindness and friendship that I received from them.

      Finally I would like to acknowledge the understanding and patience of my daughter, my husband and my family who were enormously supportive at every moment.


      Le syndrome des anticorps antiphospholipides a été décrit en 1983. Il s'agit d'une maladie auto-immune caractérisée par des taux élevés d'anticorps antiphospholipides (APLA) associés à des thromboses (veineuses ou artérielles) et/ou à des pertes foetales à répétition (International Consensus Statement for Definite Antiphospholipid Syndrome). Le syndrome des anticorps antiphospholipides peut se manifester de manière isolée ou accompagner d'autres pathologies, en particulier des maladies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique.

      Plusieurs études ont montré que les APLA sont capables d'activer les cellules endothéliales (CE) in vitro. Les mécanismes liés à cette activation sont un des sujets de recherche de la Division d'Angiologie et d'Hémostase. Il a été observé qu'un anticorps monoclonal reconnaît un phospholipide anionique nommé acide lysobisphosphatidique (Kobayashi et al, 1998; Galve-de Rochemonteix et al, 2000). Les études suivantes ont montré que l'acide lysobisphosphatidique est une cible importante pour les APLA, et que les APLA s'accumulent dans les endosomes tardifs des CE isolées des veines ombilicales en redistribuant l'insulin-like growth factor 2/ mannose-6-phosphate receptor (CI-M6PR) de l'appareil de Golgi aux endosomes tardifs. De manière concomitante, il a été découvert que la beta2 glycoprotéine I (b2GPI) s'accumule sur la surface cellulaire des endosomes tardifs et modifie le trafic des protéines intracellulaires. Ceci a en particulier été démontré par la redistribution du CI-M6PR de l'appareil de Golgi à l'intérieur des endosomes tardifs (Dunoyer-Geindre et al, 2001).

      Les mécanismes par lesquels les APLA induisent un phénotype thrombotique ont également été étudiés dans la Division. Nous avons observé que l'incubation des CE avec des anticorps anti-b2GPI provoque la redistribution du facteur de transcription nucléaire kB (NFkB) du cytoplasme dans le noyau (Dunoyer-Geindre et al, 2002). Cette redistribution du NFkB est importante pour l'activation des CE et est accompagnée d'une augmentation de l'expression du facteur tissulaire et des molécules d'adhésion leucocytaires ICAM-1, VCAM-1 et E-sélectine (Dunoyer-Geindre et al, 2002). Des études récentes ont montré que l'activation des CE par les APLA provoque un phénotype endothélial pro-inflammatoire accompagné d'une adhésion des monocytes à l'endothélium et par la suite une pénétration dans le sous-endothélium (Pierangeli et al, 2000). D'autres études ont mis en évidence une corrélation entre l'augmentation des molécules d'adhésion par certains anticorps monoclonaux anti-b2GPI et la résorption foetale observée chez des souris (George et al, 1998).

      Notre travail a porté principalement sur l'effet des statines sur les changements des CE lorsqu'elles sont incubées avec du TNF ou des APLA. Notre hypothèse était que les patients avec APLA pourraient bénéficier d'un traitement par les statines. En effet ces médicaments ont de nombreuses autres actions que la seule inhibition de la biosynthèse du cholestérol. Ces effets dits pleiotropiques pourraient expliquer également leurs effets cliniques bénéfiques sur la régression des lésions athérosclérotiques et sur la réduction des complications cardiovasculaires (Scandinavian Study group, 1994; Hebert, 1997). Nous avons cherché à voir si in vitro l'ajout de statines permettait de diminuer le phénotype pro-inflammatoire des CE incubées avec du TNF ou des APLA. De manière inattendue, nous avons observé que les statines augmentaient l'effet des APLA ou du TNF sur l'expression des molécules d'adhésion. Nous avons ensuite étudié les mécanismes pouvant expliquer cet effet. Nous avons pu démontrer que l'effet des statines était bloqué par une co-incubation avec le mévalonate ou le geranylgeranyl pyrophosphate et mimé par le GGTI-286, un inhibiteur de la geranylgeranyl transférase.

      En résumé nos résultats montrent que l'effet des APLA sur les cellules endothéliales in vitro est augmenté par les statines et que l'effet des statines est dû à des modifications de protéines geranylgeranylées.

      Keywords : antiphospholipid syndrome, endothelial cell, E-selectin, VCAM-1, antiphospholipid antibodies, statin, TNF-a, geranylgeranyl transferase


ACA
anticardiolipin antibodies
APC
activated protein C
APC-R
activated protein C resistance
APLA
antiphospholipid antibodies
APS
antiphospholipid syndrome
aPTT
activated partial thromboplastin time
b2GPI
beta2 glycoprotein I
CAM
cell adhesion molecules
CI-M6PR
cation-independent mannose-6-phosphate receptor
CL
cardiolipin
CRP
C-reactive protein
dPT
dilute prothrombin time
dRVVT
dilute Russell's viper venom time
EC
endothelial cells
EDRF
endothelium-derived relaxing factor
EGF
epidermal growth factor
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
eNOS
endothelial nitric oxide synthase
ET-1
endothelin-1
FCS
foetal calf serum
FPP
farnesylpyrophosphate
FTase
farnesyltransferase
FTI-277
farnesyltransferase inhibitor-277
GGPP
geranylgeranylpyrophosphate
GGTase
geranylgeranyltransferase
GGTI-286
geranylgeranyltransferase inhibitor-286
HMG-CoA
3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A
HRP
horseradish peroxidase
HSVEC
human saphenous vein cells
HUVEC
human umbilical vascular endothelial cells
INR
international normalized ratio
KCT
kaolin clotting time
LA
lupus anticoagulant antibodies
LFA-1
b2 integrin function antigen-1
MCP-1
monocyte chemoattractant protein-1
MHC
major histocompatibility complex
MMP
matrix metalloprotease
NFkB
nuclear factor kB
NO
nitric oxide
OPD
o-phenylenediamine dihydrochloride
PA
phosphatidic acid
PAI-I
plasminogen activator inhibitor type I
PC
phosphatidylcholine
PE
phospatidylethanolamine
PGI2
prostacyclin
PI
phosphatidylinositol
PL
phospholipid
PS
phosphatidylserine
Pt
prothrombin
SMC
smooth muscle cells
SLE
systemic lupus erythematosus
TAT
thrombin-antithrombin complexes
TM
thrombomodulin
vWF
von Willebrand factor

      Antiphospholipid syndrome (APS) is an autoimmune disease characterized by the persistent presence of antiphospholipid antibodies (APLA) associated with venous and arterial thrombosis as well as foetal loss. APLA constitute a heterogeneous family of antibodies which play a pathogenic role rather than just being a diagnostic marker of APS. The thrombophilic state has been partially related to the interactions of APLA with endothelial cells (EC). Due to their multiple properties on EC and the numerous favourable clinical trials, the use of statins has also been advocated for patients with APS. Indeed, besides their cholesterol-lowering activity, statins may influence several events in the vessel wall by blocking the mevalonate synthesis and inhibiting the production of down-stream metabolites, such as geranylgeranylpyrophosphate (GGPP) and farnesylpyrophosphate (FPP), that play a major role in the intracellular modification of important signaling proteins as Rho and Ras.

      In this study we investigated whether adhesion molecule expression induced by APLA on EC is influenced by various statins, namely simvastatin, fluvastatin and pravastatin. The effect of APLA was compared with TNF-a and LPS. Contrary to what could be expected, we consistently found in our experimental conditions that pretreatment with statins potentiated the APLA-induced expression of E-selectin and VCAM-1 on EC. Mevalonate reversed the potentiating effect of these statins. Studying further the mechanism of these effects of statins revealed that GGPP also reversed the potentiating effect of simvastatin or fluvastatin on adhesion molecule expression, while FPP only partially reversed this effect. Furthermore, we observed that the specific geranylgeranyltransferase inhibitor GGTI-286, but not the farnesyltransferase inhibitor FTI-277, mimicked the effect of simvastatin and fluvastatin by increasing the TNF-a and APLA mediated overexpression of E-selectin and VCAM-1.

      In conclusion, statins increase E-selectin- and VCAM-1-induced expression on vascular endothelial cells stimulated with antiphospholipid antibodies. The inhibition of geranylgeranylated protein could contribute to this effect. Our data indicate that other experimental data should be performed before giving statins to APS patients.


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