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1. Introduction et but de l'étude


1.1 Introduction

      De 1995 à 1997 en Suisse Romande, il n'a pas été possible de poser un diagnostic précis chez soixante-dix à quatre-vingts patients sur plus de deux cents investigués en raison d'une symptomatologie de fatigabilité et/ou de douleurs musculaires. Un petit nombre d'entre eux présentait des anomalies biologiques et/ou histologiques telles que, dans le sang, des enzymes musculaires légèrement au-dessus de la norme ou, histologiquement, une accumulation mitochondriale sous-sarcolemmale discrète ou une augmentation des gouttelettes lipidiques dans le muscle squelettique. Bien que compatibles avec une mitochondriopathie, ces anomalies restent non spécifiques, pouvant se rencontrer dans presque toute pathologie musculaire métabolique ou même structurelle parfois, comme par exemple l'accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries dans la maladie de Duchenne avancée.

      La mitochondrie est une organelle impliquée dans plusieurs processus métaboliques ne se limitant pas uniquement à la production d'ATP, bien que ce soit dans la plupart des tissus son rôle prépondérant. De nombreux enzymes, transporteurs et substrats participent à la synthèse d'ATP et théoriquement, tout déficit suffisamment intense dans l'une ou l'autre de ces voies métaboliques amène à un trouble fonctionnel mitochondrial. Ainsi, les pathologies mitochondriales forment un groupe hétérogène de troubles métaboliques, caractérisés par des anomalies ultrastructurelles mitochondriales ou du métabolisme oxydatif (OXPHOS).

      D'autre part, il faut distinguer différents degrés de gravité physiopathologique. Les déficits enzymatiques touchant directement un enzyme essentiel du cycle de Krebs (déficit en fumarate par exemple) ne permettent pas la survie et les patients atteints décèdent souvent rapidement après la naissance. D'autres déficits semblent se manifester de façon moins bruyante et présentent une évolution plus lente, tels les mitochondriopathies liées à la carnitine ou à son récepteur. Toutes ces pathologies prennent leur origine dans des anomalies génétiques nucléaires.

      Nous nous sommes plus particulièrement intéressés au métabolisme OXPHOS. Le métabolisme OXPHOS est responsable de la production d'ATP à l'intérieur de la chaîne respiratoire mitochondriale qui est composée de plusieurs étapes, dont font partie cinq complexes enzymatiques (Complexes I à V). Les différentes sous unités (molécules structurales) de ces complexes sont génétiquement codées en grande partie par le génome nucléaire, en plus petite partie (molécules fonctionnelles) par le génome mitochondrial. Cependant, les anomalies du fonctionnement du métabolisme OXPHOS sont dues à des mutations du DNA mitochondrial (mtDNA), et rarement à des mutations des gènes nucléaires codant pour les complexes respiratoires mitochondriaux, par exemple les gènes codant pour la protéine frataxine dans le cas de l'ataxie de Friedreich [1].

      Les mitochondriopathies dues à des mutations du mtDNA sont d'apparition tardive et de progression lente. Plusieurs travaux ont démontré que le pourcentage de mutation mtDNA doit dépasser les 75 à 80% avant qu'une mitochondriopathie ne se manifeste cliniquement et qu'elle puisse être détectée histologiquement ou biochimiquement [2,3], c'est à dire, pour que le seuil où la demande énergétique du tissu dépasse l'apport, soit atteint (cf. plus loin " L'effet de seuil "). D'autres examens tels que l'ENMG (électro-neuro-myogramme) ou le test d'effort n'ont pas une sensibilité ou spécificité suffisante pour mettre en évidence une perturbation modérée. L'analyse du génome mitochondrial reste aléatoire par le fait que plusieurs mutations peuvent se manifester par des symptômes identiques et inversement, une même mutation du mtDNA peut se manifester par des tableaux cliniques différents[4].

      De nombreux syndromes dus à une ou plusieurs anomalies du mtDNA ont été décrits dans la littérature médicale (Syndrome de Leigh, LHON, ophtalmoplégie externe progressive ou CPEO, syndrome MERRF, etc.) et parfois l'équipe médicale peut poser un diagnostic parce que les symptômes sont bruyants et le taux de mutation de mtDNA suffisamment important pour être détecté (cf. table 6). Bien plus souvent, il s'agit de tableaux cliniques intermédiaires avec une symptomatologie bâtarde et d'apparition progressive où le médecin ne sait pas vers quel diagnostic s'orienter, mais où il suspecte un dysfonctionnement du métabolisme mitochondrial [1].

      L'ensemble de ces raisons fait qu'encore actuellement, les médecins et les chercheurs rencontrent d'importantes difficultés dans le cheminement diagnostique des mitochondriopathies.

      Une autre caractéristique essentielle des dysfonctionnements mitochondriaux est l'effet de seuil, notion qui vient encore accentuer la difficulté du diagnostic.


1.1.1 L'effet de seuil [3, 5-7]

      Il existe deux effets de seuil d'après une théorie émise en 1997 par l'équipe du laboratoire de J.-P. Mazat [3]. Chaque tissu, chaque colonie de mitochondrie, chaque mitochondrie elle-même possède un pool mixte de mtDNA natif (non muté) et de mtDNA muté, de proportion variable : c'est l'hétéroplasmie. Le premier effet de seuil (seuil biochimique) en est la conséquence et il sera plus ou moins bas selon la proportion de mtDNA natif/mtDNA muté présente dans le tissu.

      Le deuxième effet de seuil est lié à la demande énergétique de l'organe impliqué (seuil énergétique).

      On parle du double effet de seuil qui résulte de la dynamique de production d'ATP par la chaîne respiratoire mitochondriale et de la demande en ATP du tissu.


1.2 Moyens d'investigation à disposition

      Différents types d'investigations in vitro sont disponibles dans la recherche d'une myopathie mitochondriale.

      L'Histologie musculaire permet au moyen de plusieurs colorations chimiques et marquages immunohistochimiques de mettre en évidence certaines anomalies, malheureusement non spécifiques, telles que des Red Ragged Fibers (RRF), accumulations sous-sarcolemmales de mitochondries, un déficit spécifique en Déhydrogénase (SDH) ou en Cytochrome c Oxydase (COX). On peut également déterminer le nombre et la taille des gouttelettes lipidiques (coloration ORO), la distribution du glycogène (coloration PAS), la distribution et la proportion des fibres de type 1 (coloration du NADH) ou de type 2 (coloration ATPase).

      La Biochimie permet parfois de mettre en évidence certains déficits d'activité in vitro des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale [8, 9]. Dans le cadre de ce travail de recherche, nous avons désiré mesurer les " activités spécifiques " et " activités rapportées " à la Citrate Synthase des complexes I, II, III, IV, II partiel (SDH) et du segment II-III [8].

      La mesure du contenu en Carnitine, effectué de routine dans la Clinique de Pédiatrie, a également été mesurée dans le cadre d'une étude à Genève. Les maladies touchant ce transporteur d'acyl se rencontrent plutôt dans l'enfance. Toutefois elles concernent indirectement le fonctionnement mitochondrial et nous avons désiré mesurer le contenu en carnitine chez les adultes inclus dans cette étude, en particulier ceux dont l'analyse histologique avait révélé une accumulation anormale de gouttelettes lipidiques.

      L'analyse de la génétique mitochondriale a également été effectuée, ceci de la façon la plus ciblée possible en fonction des éventuelles anomalies découvertes à l'oxymétrie et lors de la mesure d'activité biochimique. Les délétions et les mutations ponctuelles les plus fréquentes de l'ADN mitochondrial humain ont été recherchées dans un premier temps (cf. table 6) et, dans un deuxième temps, selon les anomalies oxygraphiques et/ou histologiques etc., les altérations moins fréquentes, mais plus spécifiques.

      Malheureusement, ces examens in vitro sont limités par leur manque de spécificité et de sensibilité. En effet, les altérations histologiques et ultrastructurelles rencontrées dans les mitochondriopathies peuvent également se voir dans d'autres situations " normales " comme chez les sportifs de haut niveau ou " anormales " comme les myopathies structurelles telles que la maladie de Duchenne ou d'autres pathologies neuromusculaires, chez les patients sidéens sous AZT ou encore dans le myocarde ischémié [10-12]. De plus, la présence d'une activité biochimique dans un intervalle de normalité ou le marquage positif à l'histologie d'un enzyme de la chaîne respiratoire n'exclut en rien une anomalie fonctionnelle mitochondriale.


1.3 Hypothèse de travail

      Comme nous l'avons déjà souligné, la sensibilité et la spécificité des méthodes d'investigation actuelles des mitochondriopathies sont insuffisantes. Il fallait trouver un instrument diagnostique plus précis.

      Notre hypothèse de travail repose sur le fait que la mitochondrie consomme de l'oxygène pour oxyder les substrats et produire de l'ATP lors de la phosphorylation oxydative. Cette consommation peut être mesurée dans un volume fermé, par un oxygraphe composé d'une électrode à haute résolution placée dans une chambre de mesure constituée de matériaux inertes vis à vis l'oxygène [13, 14, 16, 17, 21, 22]. Par ce moyen, nous pouvons déterminer deux valeurs, le flux maximal d'oxygène ou consommation maximale au stade 3 de la respiration (cf. table 4) [23], et les coefficients de contrôle des complexes respiratoires de la chaîne mitochondriale. Ces valeurs devraient permettre une caractérisation fonctionnelle d'une population de mitochondries représentative d'un groupe de fibres musculaires " perméabilisées " (cf. Méthode). Nous insistons sur l'aspect fonctionnel des mesures car il s'agit d'étudier le métabolisme mitochondrial dans des conditions quasi physiologiques. Ceci est un concept nouveau dans les moyens diagnostics de dysfonctionnement mitochondrial.


1.3.1 But de l'étude

      Plusieurs groupes de recherche français, allemands et autrichiens s'intéressent depuis plus de quinze ans au métabolisme mitochondrial [13-16]. En particulier, ils ont employé une méthode d'investigation fonctionnelle, la Respirométrie ou Oxymétrie [17] utilisant des fibres musculaires perméabilisées par de la saponine [18].

      La théorie de l'Analyse du Contrôle Métabolique développée dans les années 70 par Heinrich, Burns, Kacser et Rapoport s'appuie sur le concept d'homéostasie et permet une approche beaucoup plus physiologique des processus métaboliques [19, 20]. Elle permet notamment de déterminer les coefficients de contrôle, c'est-à-dire l'effet limitant de chaque complexe respiratoire mitochondrial sur le fonctionnement de l'ensemble de la chaîne de la phosphorylation oxydative.

      Appliquant ces méthodes, la Division de Recherche Neuromusculaire et la Clinique et Policlinique d'Orthopédie et Chirurgie de l'Appareil Moteur des Hôpitaux Universitaires de Genève ont entrepris, d'une part d'optimaliser l'investigation respirométrique à haute résolution, et d'autre part de déterminer son applicabilité clinique de routine dans le diagnostic des mitochondriopathies musculaires.

      L'étude clinique s'est déroulée sur un an et a porté sur 33 sujets " contrôles " et 26 sujets souffrant de symptômes musculaires, désignés sous le terme " investigués ". Les 26 sujets investigués avaient une moyenne d'âge de 38.2 années (19-80, médiane 34.5). Il s'agissait de 14 personnes de sexe masculin (âge moyen 38.6, médiane 36) et de 12 personnes de sexe féminin (âge moyen 39.3, médiane 35).

      Le protocole d'étude, les méthodes précises appliquées, la description des sujets " contrôles " et " investigués " ainsi que leurs résultats sont décrits dans ce qui suit.


2. Analyse du Contrôle Métabolique [24]

      L'oxygraphe à haute résolution est un appareil de haute précision permettant de mesurer des variations de concentration d'oxygène dans un volume fermé. Appliquant la théorie de l'Analyse du Contrôle Métabolique (en anglais Metabolic Control Analysis ou MCA), nous pouvons obtenir au moyen de cet appareil des informations sur la fonction mitochondriale in vitro dans des conditions d'homéostasie.

      Nous allons donc maintenant exposer la théorie du MCA en définissant un " coefficient de contrôle " que nous allons déterminer dans la partie expérimentale pour chacun des patients inclus dans cette étude.


2.1 Régulation et Contrôle d'un processus enzymatique

      La Régulation peut se définir comme l'ensemble des moyens qu'un système métabolique possède pour répondre aux altérations environnementales dans le but de maintenir l'homéostasie.

      Le Contrôle quant à lui correspond au pouvoir de modifier l'homéostasie par une action extérieure ou stimulus. Son étude nous permet de déterminer quels sont les sites ou les mécanismes impliqués dans le dysfonctionnement d'un organisme, mais nous permet également de trouver comment les altérer afin de rétablir autant que possible l'homéostasie.

      Ces deux notions sont importantes dans l'étude moderne de la Biochimie. La Biochimie Classique nous apprend l'existence d'enzymes ou d'étapes limitantes dans un processus métabolique. Elles sont le siège de l'activité enzymatique la plus lente dans une chaîne métabolique et toute variation de cette activité est sensée influencer la cinétique de la chaîne. Ce concept n'est applicable qu'à un équilibre statique et non dynamique. Ce dernier est également appelé homéostasie.


2.2 Homéostasie: un équilibre dynamique

      En physiologie, l'homéostasie est la capacité d'un organisme à maintenir sa composition constante (on ne tient pas compte du vieillissement dans cette définition) tout en consommant des substrats d'un côté et excrétant des produits à l'autre bout. Cet organisme ne peut donc maintenir son état que par ce flux constant de matière et d'énergie à travers les voies métaboliques de ses cellules. Jamais un véritable équilibre n'est atteint car cela signifierait l'accumulation d'un produit quelque part dans la chaîne et finalement la mort de l'organisme.

      Mathématiquement, nous pouvons considérer qu'un système en homéostasie tend toujours vers un équilibre sans jamais l'atteindre.


2.3 Thermodynamique des voies métaboliques

      La thermodynamique classique concerne les systèmes fermés où le seul équilibre qui peut résulter est l'équilibre chimique. Les organismes vivants au contraire sont considérés comme des systèmes ouverts où peut se développer un équilibre dynamique.

      Dans la thermodynamique classique, la variation d'énergie libre DG à l'équilibre est égale à zéro, mais n'est pas égale à zéro si la réaction est déplacée de l'équilibre.

      Dans la réaction:

      A + B D C + D

      L'énergie libre de cette réaction à une concentration donnée de substrats et produits à pH 7 est de DG'. Elle est relié à l'énergie libre standard DG0' (définie comme l'énergie libre lorsque le pH = 7) par l'équation:

      DG' = DG0' + R*T*ln(CD/AB) (1.1)

      Le rapport d'action de masse G est défini comme le rapport des produits CD/AB. A l'équilibre, DG' = 0 et G = Keq (constante d'équilibre) et donc finalement:

      DG0' = - R*T*ln(Keq) (1.2)

      Par substitution:

      DG'= - R*T*ln(Keq) 1 R*T*ln(G) (1.3)

      et

      DG' = R*T*ln(Keq / G) et (Keq / G) = r(1.4)

      Dans cette équation, r est appelé index de déséquilibre. Il nous donne une mesure du déplacement de la réaction par rapport à l'équilibre. En effet, si DG'= 0, alors r = 1.

      Et si DG'< 0, alors, r >1. On verra plus loin que la valeur de r nous est utile pour déterminer si une réaction est potentiellement un site de régulation ou de contrôle.

      Classiquement, les réactions biochimiques peuvent être décrites comme étant en non-équilibre (non-equilibrium) ou proches de l'équilibre (near-equilibrium). Dans ces cas, r peut être respectivement soit très petit, soit très grand. On peut également les définir comme les réactions ayant respectivement une énergie libre très négative (non-equilibirum) ou très proche de zéro (near-equilibrium). Dans ce dernier cas de figure, si l'on prend l'équation (1.2), lorsque l'on se rapproche de l'équilibre, DG' tend vers 0 et donc Keq tend vers 1. Pour des raisons physiologiques (forces osmotiques), on peut supposer que les concentrations de substrats et de produits doivent être de l'ordre du micromolaire ou du millimolaire, et partant, les réactions avec un Keq très élevé se maintiendront loin de l'équilibre pour que les concentrations de métabolites restent dans le domaine physiologique. A l'inverse, les réactions possédant un Keq faible (proche de 1) devront être proches de l'équilibre. Cette théorie a été démontrée mathématiquement en 1974 par Heinrich et Rapoport [25]. De même, Atkinson [26, 27] a insisté sur le fait que les réactions de couplage d'énergie libre, telles que la production d'ATP, doivent être loin de l'équilibre. Ceci constitue une autre définition de l'homéostasie.


2.4 Réactions de non-équilibre et contrôle métabolique

      On peut théoriquement démontrer que les réactions de non-équilibre seraient celles qui influencent de façon significative le flux métabolique d'une chaîne enzymatique.

      Soit la réaction réversible suivante:

      

      vf: vitesse 'forward', de la réaction A vers B

      vr: vitesse 'backward' de la réaction B vers A

      On peut également définir la vitesse vi comme une constante ki multipliée par la concentration du substrat ou du produit. Ainsi, vf = kf * A et vr = kr * B. Puisqu'à l'équilibre B/A = Keq, donc

      Keq = kf / kr (1.5)

      Si l'on considère des conditions de non-équilibre on peut définir ce rapport autrement :

      (kr* B) /( kf* A) = G* (kr / kf)

      et G / Keq = r (1.6)

      Maintenant si l'on accepte que cette réaction réversible a fini par atteindre un état stationnaire tel qu'il existe un flux constant vp à travers elle :

      

      La condition nécessaire à l'état stationnaire est que : vf - vr = vp

      Ainsi :

      

      Rappel : r = rapport de déséquilibre

      Et finalement,

      vp/vf = 1-r (1.7)

      Il faut se souvenir (Eq. 1.4) que l'équilibre (vf = vr) est atteint lorsque r = 1. Dans ce contexte d'état stationnaire, puisque vp > 0, cette réaction ne pourra être que proche de l'équilibre (near-equilibrium) si vf >> vp de telle manière que vf » vr. Par contre, une réaction de non équilibre (non-equilibrium) possède alors un r proche de 0 de telle façon que vp » vf.

      Cette démonstration est séduisante et nous amènerait à définir les réactions de non équilibre comme potentiellement limitantes (car vp » vf) dans une voie métabolique au contraire des réactions de " near-equilibrium ". Les expériences de laboratoire ont montré que ce n'était pas le cas. L'une des carences de cette théorie réside dans l'omission de l'effet du ou des produits sur les réactions en amont de la chaîne enzymatique. L'autre erreur consiste à ne s'être concentré que sur une étape et ne pas avoir considéré toute la chaîne.


2.5 Principes de Régulation et de Contrôle

      Le terme de " étape limitante " dans une chaîne métabolique est erroné. A l'origine elle est définie comme l'étape possédant la vitesse enzymatique la plus lente dans une chaîne métabolique. Cependant plusieurs questions restées sans réponse ont toujours remis en cause cette définition. De plus, les résultats expérimentaux ont montré qu'en réalité le flux métabolique à travers une chaîne enzymatique dépendait de la cinétique de chaque réaction.

      Plutôt que d'étape limitante ou enzyme limitant, il faut parler d'enzyme régulateur. Deux rôles peuvent être distingués pour un tel enzyme:

  1. Homéostasie métabolique : adaptation de la consommation ou de la production d'un métabolite au reste du métabolisme, impliquant des signaux internes. Exprimé par le coeff. d'élasticité (e).
  2. Contrôle : pouvoir de changer l'état d'une chaîne métabolique en réponse à des stimulis extérieurs. Exprimé par les coeff. de contrôle (Ci), mesure quantitative du contrôle.

      Le coefficient de contrôle est une mesure quantitative et spécifique de l'effet régulateur qu'exerce un complexe sur le flux métabolique de toute la chaîne respiratoire, dans le cas ici de la mitochondrie. Il existe différentes méthodes pour mesurer un coefficient de contrôle : la régulation de l'expression génétique d'un enzyme, la régulation de cofacteurs nécessaires au fonctionnement de l'enzyme et d'autres moyens sur lesquels on ne s'étendra pas. Dans toutes ces situations il s'agit de faire varier l'activité biochimique d'un enzyme afin d'étudier l'effet de cette variation sur le flux métabolique et, par-là, définir le contrôle qu'exerce l'enzyme sur ce flux.

      Dans cette étude, nous avons utilisé une méthode permettant de faire varier l'activité biochimique de différents enzymes de la chaîne respiratoire mitochondriale: la titration à l'aide d'un inhibiteur spécifique.

      La théorie du contrôle métabolique part du principe qu'il n'existe pas d'étape limitante dans une chaîne métabolique avec un flux constant, c'est-à-dire en état stationnaire. Plusieurs paradoxes ont permis d'arriver à cette conclusion: les biochimistes de la première moitié du vingtième siècle étaient d'accord sur l'existence d'un enzyme limitant dans une chaîne métabolique, mais ne s'entendaient pas sur sa localisation. Comment pouvait-il exister une étape la plus lente alors qu'à l'équilibre tous les enzymes travaillent à la même vitesse ? Pourquoi n'arrivait-on pas à accélérer la production d'un métabolite en augmentant la concentration de son enzyme limitant, ce qui aurait dû se produire d'après la théorie de l'étape limitante ?


2.6 Concept du Coefficient de Contrôle

      Dans la théorie de l'étape limitante, la question est de savoir s'il existe un enzyme limitant. La réponse est restrictive: 'oui' ou 'non'. Dans la théorie du Contrôle Métabolique il s'agit de savoir comment (qualitativement) ou combien (quantitativement) la variation d'activité d'un enzyme va influencer le flux à travers une chaîne métabolique. Les possibilités de réponses sont plus riches, les protagonistes également plus nombreux puisque l'on considère en même temps plusieurs réactions biochimiques.

      Pour définir théoriquement le coefficient de contrôle, prenons une voie métabolique en état stationnaire avec une source (X0) et une sortie (XI) telle que représentée sur la figure 1.

      

Fig. 1 : Voie métabolique en état stationnaire avec une source (X0) et une sortie (XI)

      Si l'on s'intéresse à l'étape ydh et son flux spécifique Jydh et que ce flux (ou activité de l'enzyme) est exprimé sur un graphique (fig. 1-b) en fonction de la variation de concentration de l'enzyme correspondant Exase, on peut alors définir un 'domaine limitant' et un 'domaine non-limitant' de l'enzyme sur ce même graphique. Le premier est défini comme l'intervalle sur l'abscisse où une faible variation dans la concentration enzymatique provoquera une forte variation du flux (ou activité) de l'enzyme. Inversement, le 'domaine non-limitant' correspond à l'intervalle où une forte variation de concentration ne provoquera qu'un faible changement du flux.

      Sur cette même courbe (cf. fig. 1-b), si l'on induit un changement suffisamment faible de la concentration enzymatique, alors le rapport dJydh/dExase représente la pente de la courbe à l'endroit étudié. Elle correspond donc à une mesure quantitative du changement d'activité enzymatique suite à une variation de la concentration de ce même enzyme. A partir de là, le Coefficient de contrôle C de l'enzyme sur le flux Jydh peut être défini en éliminant les unités de la façon suivante:

      

      Ou autrement encore :

      

      Répétons qu'il ne s'agit là que d'une définition théorique et que les chercheurs ne se sont intéressés aux moyens de mesurer expérimentalement les coefficients de contrôle que plus tard. A noter que le coefficient de contrôle peut également être défini à partir d'un graphique exprimé en logarithmes (cf. fig. 1-c).

      Mathématiquement, le coefficient de contrôle étant défini essentiellement comme la pente d'une courbe, il ne peut varier qu'entre une valeur minimale de -1 et maximale de +1. Une valeur située entre -1 et 0 signifie qu'il existe des embranchements métaboliques dans l'étape enzymatique que l'on étudie. Une valeur de +1 signifie qu'une variation x de la concentration de l'enzyme provoque une variation de proportion identique du flux (ou activité). En réalité, la définition du coefficient de contrôle stipule que les valeurs extrêmes ne sont jamais atteintes, le coefficient 'tend vers' sans jamais atteindre. Il est intéressant toutefois de constater que théoriquement un enzyme avec un coefficient de contrôle de 1 est un enzyme limitant. Expérimentalement, l'équilibre biochimique n'existe pas, et par conséquent l'enzyme possédant un coefficient de 1 (ou de -1) n'existe pas non plus.

      L'expérimentation génétique sur des organismes diploïdes comme la drosophile (Drosophila Melanogaster) a démontré théoriquement que la grande majorité des enzymes possédait des coefficients de contrôle très faibles (conclusion théorique basée sur une observation génétique par Fisher RA, 1928, [24]).

      La définition mathématique telle que proposée par Kacser et Burns en 1973 [20] est donc comme nous l'avons déjà présentée plus haut :

      

      Cette dernière équation définit le coefficient de contrôle Ci comme la mesure quantitative du changement fractionnel du flux dans une voie métabolique induit par un changement fractionnel de l'activité de l'enzyme considérée. Il faut rappeler que Jydh est le flux d'une étape métabolique tel que déterminé par l'activité de l'enzyme Exase.

      Kacser, Burns, Heinrich et Rapoport ont également énoncé le théorème de la somme que nous avons décrit plus haut. Il stipule que si les concentrations du substrat initial et du produit final sont maintenues constantes, alors la somme des coefficients de contrôle dans la voie métabolique en question est égale à 1. Kacser et Burns ont aussi démontré que l'effet d'un inhibiteur sur le flux d'une voie métabolique dépendait de deux paramètres [20] :

  1. l'effet de l'inhibiteur sur l'enzyme lorsque celui-ci est isolé et lorsqu'il est inclus dans une voie métabolique
  2. le contrôle exercé par l'enzyme sur la voie métabolique

      Ceci est exprimé selon la relation suivante :

      

      J = flux dans la voie en homéostasie (ss = steady state)

      I = concentration de l'inhibiteur

      vi = vitesse de l'enzyme quand isolée de la voie métabolique mais soumise à des concentration similaires de substrat et de produit au flux J dans la voie métabolique (Si et Pi).

      De cette équation on peut déterminer mathématiquement et expérimentalement le coefficient de contrôle d'un enzyme lorsque la concentration de l'inhibiteur I tend vers zéro. Nous obtenons donc :

      

      Le numérateur de cette équation peut être dérivé de la pente initiale de la courbe de titration à l'inhibiteur. Le dénominateur quant à lui peut être calculé à partir des caractéristiques d'inhibition de l'enzyme, réversible ou irréversible. Lorsque l'inhibiteur est irréversible, le coefficient de contrôle peut être calculé directement à partir de la courbe de titration [28] en utilisant la formule suivante :

      

      Une expérience décrite dans cet article laisse supposer de façon intéressante qu'il n'existe pas une seule étape de contrôle ou étape limitante, mais que le contrôle métabolique est distribué sur plusieurs autres étapes [28]. Dans le cas de la chaîne respiratoire mitochondriale, l'un de ces autres éléments de contrôle est la perméabilité passive de la membrane mitochondriale aux protons (" proton leak ") qui est d'autant plus important en expérimentation que la température d'incubation est élevée.

      Les inhibiteurs réversibles peuvent être compétitifs ou non compétitifs. Nous n'avons travaillé qu'avec des inhibiteurs non compétitifs, à nouveau pour des questions de facilité technique et de disponibilité de temps. La formule telle que proposée par Groen [28] est :

      

      Ci = Coefficient de contrôle.

      Ki = constante de dissociation.

      dJ/dI = pente des premiers points d'une courbe flux en fonction de la dose d'inhibiteur.

      J = flux maximal (I = 0)

      Dans le cas des inhibiteurs réversibles, nous devons tenir compte du fait que l'enzyme se trouve sous deux formes en présence de l'enzyme qu'il inhibe, libre et en complexe avec l'enzyme, selon l'équilibre : E + I D EI.

      Cet équilibre est régi par une constante de dissociation Kd ou Ki, exprimée dans la formule plus haut et qui peut être déterminée pour chaque inhibiteur en utilisant une méthode biochimique d'inhibition par titration de l'enzyme cible. Elle dépend entre autres de la température d'incubation des réactifs. Nous aurions souhaité mesurer les valeurs de Kd à une température de 30°C puisque c'est dans ces conditions que les fibres musculaires étaient incubées dans l'oxygraphe. Cependant pour des raisons de disponibilité du laboratoire de biochimie, nous avons finalement utilisé les valeurs de Kd déterminées par Kunz à 25°C pour l'azide et l'amytal [29] [30]. Notre hypothèse est que la différence étant probablement proportionnelle, l'interprétation des valeurs mesurées n'en est pas altérée.

      La Kd de l'amytal à 25°C telle que calculée sur une courbe spectrophotométrique obtenue par titration du complexe I était de 170mM.

      La Kd de l'azide calculée de la même façon, mais par titration du complexe IV était de 64mM.

      Comme on peut assez aisément le comprendre, l'abscisse d'une courbe de titration à l'inhibiteur peut être exprimée en concentration soit de l'enzyme soit de l'inhibiteur. Nous avons décidé d'utiliser la concentration de l'inhibiteur puisque la concentration de l'enzyme intra mitochondrial étudié, c'est-à-dire de l'un des complexes de la chaîne respiratoire, est difficile à mesurer.


2.7 Le Théorème de la Somme (" Summation Theorem ")

      Défini par Kacser et Burns en 1973 [19], ce théorème stipule que dans une chaîne métabolique linéaire (sans embranchements) en équilibre dynamique (homéostasie) en condition de saturation (stade III de la respiration dans la mitochondrie, (cf. table 4) le contrôle du flux est partagé entre les différents intervenants de la chaîne. Ceci s'exprime mathématiquement par :

      

      Théoriquement ceci implique que la somme des coefficients de contrôle de tous les enzymes présents dans une cellule est égale à 1. En pratique, on peut émettre l'hypothèse que des enzymes connectés de façon très distante les uns des autres n'ont que peu d'influence sur leurs voies métaboliques respectives. En d'autres mots, leurs coefficients de contrôle sur une voie métabolique distante tendent vers ou sont égaux à zéro.

      Dans la discussion des résultats, nous reviendrons sur ce théorème et l'information qu'il peut nous apporter dans l'étude du contrôle métabolique.

      Dans la section suivante, nous allons présenter notre méthodologie et exposer comment nous avons appliqué expérimentalement la théorie du " coefficient de contrôle " sur des mitochondries de fibres musculaires " perméabilisées ".


3. Méthode


3.1 Le prélèvement musculaire

      Nous sommes partis de l'hypothèse que, puisque l'oxymètre mesure une consommation d'oxygène et que l'appareil possède une sensibilité de 1 à 2 pmol/seconde (data transmis par E. Gnaiger, concepteur de l'appareil), il devait certainement être capable de détecter des différences de flux entre différentes localisations anatomiques. Il était donc important de focaliser l'investigation sur un muscle particulier. En effet, selon leur localisation, les muscles ont des fonctions différentes qui se traduisent histologiquement par des populations de fibres soit à majorité de type 1 (fibres dites lentes, riches en mitochondries et fonctionnant sur le métabolisme oxydatif) soit à majorité de type 2 (fibres dites rapides, pauvres en mitochondries et fonctionnant sur le métabolisme anaérobique). Il était également primordial, pour déterminer des valeurs oxymétriques de contrôle, de choisir un muscle facilement accessible et fréquemment exposé lors d'interventions orthopédiques. Nous avons opté pour le muscle deltoïde qui possède en outre d'autres avantages :

      Les arguments qui viennent d'être exposés nous ont logiquement amené à biopsier les patients suspects de pathologie mitochondriale au deltoïde. Il était évidemment prévisible que nous nous retrouverions parfois dans des situations où nous devrions prélever ce muscle du membre supérieur chez des patients présentant surtout ou exclusivement des symptômes aux membres inférieurs. C'est un désavantage puisque l'on sait que la distribution des mitochondries est hétéroplasmique non seulement dans les cellules d'un tissu donné, mais également entre tissus de localisations différentes, une condition résultant de la ségrégation réplicative lors de l'embryogenèse. Cependant, on peut aussi supposer que le pool mixte de mtDNA est distribué de façon homogène quel que soit la localisation et que si certains patients se plaignent des muscles des membres inférieurs, cela pourrait être lié au fait que ces mêmes muscles sont particulièrement sollicités.

      En résumé, nous avons choisi pour cette étude de biopsier le muscle deltoïde aussi bien chez les patients contrôles lors d'interventions orthopédiques en anesthésie générale, que chez les patients à investiguer. Chez ces derniers, l'intervention s'est faite en anesthésie locale.

      Les patients des deux catégories de prélèvement ont été dûment informés oralement et par écrit et ont dû signer un formulaire de consentement éclairé autorisant le prélèvement de muscle sur leur personne. Le protocole d'étude a été accepté par la commission d'éthique des Hôpitaux Universitaires de Genève.


3.1.1 Technique de prélèvement

      L'incision cutanée chez les patients contrôles a été effectuée par un chirurgien orthopédiste des HUG lors d'une intervention élective de l'épaule. Le prélèvement musculaire a toujours été effectué par la même personne (AAF) par souci de reproductibilité. L'incision cutanée chez les patients investigués était de 4cm environ, longitudinale et à la face antérieure du moignon de l'épaule au membre supérieur non dominant. Dans ce dernier cas, toute la procédure chirurgicale a été exécutée par AAF.

      

Fig. 2 : 1) matériel utilisé pour le prélèvement musculaire ; 2) matériel en place sur le muscle deltoïde exposé par une incision de 4cm env., juste avant excision du faisceau musculaire ; 3) faisceau excisé, longueur max. de 2cm.

      En haut de l'image, les prélèvements pour les analyses biochimiques, de carnitine et de génétique mitochondriale.

      Un faisceau de muscle sectionné se tétanise et libère de grandes quantités de calcium intracellulaire pouvant entraîner des altérations osmotiques des mitochondries. Pour prévenir cela, nous avons employé une technique où le muscle était soigneusement disséqué in situ avant d'être fixé par deux fils résorbables (vycril 2.0) à un tuteur en bois préalablement plongé dans du liquide physiologique (cf. fig. 2 : 1, 2, 3). Cette contrainte mécanique associée à un transport dans un milieu de relaxation à 5°C jusqu'au laboratoire (Biops, cf. plus loin pour la composition) minimise la contraction des fibres et préviennent l'épuisement des réserves énergétiques cellulaires. Les dimensions de la biopsie sont environ de 20mm pour la longueur et 3mm pour l'épaisseur ce qui représente un poids humide de 100 à 150mg. A côté de cela, nous avons également prélevé 50mg de tissu pour l'étude des activités biochimiques des complexes respiratoires (Hugues Henry et Olivier Boulat, Laboratoire Central de Chimie Clinique, CHUV, Lausanne), 50 autres mg pour la mesure de l'activité de la carnitine (Laboratoire du Prof. E. Girardin, Clinique de Pédiatrie, HUG, Genève) et encore 50 mg pour une étude histologique selon les méthodes conventionnelles (Dr G. Pizzolato, Dpt de Pathologie Clinique, HUG, Genève). A la fin de la dissection des fibres (cf. plus loin), environ 10 des 100mg de départ ont été utilisés pour l'analyse du génome mitochondrial (Dr M. Morris, Dpt de Génétique Médicale, HUG, Genève). Nous avons donc prélevé un total de 300mg environ pour chaque patient.


3.1.2 Dissection et perméabilisation

      Les mesures oxygraphiques peuvent être effectuées soit sur des mitochondries isolées, soit sur des fibres perméabilisées. Les techniques d'isolation mitochondriale sont toutefois assez traumatiques pour ces organelles et la survie n'est que de 10 à 40% [9]. Ceci impose des prélèvements plus importants, entre 500 et 1000mg de tissu musculaire.

      Il nous a donc paru plus intéressant de travailler sur des fibres musculaires perméabilisées selon la technique décrite pour les fibres musculaires cardiaques par Veksler qui permet d'accéder à 90% des mitochondries musculaires [17]. Il a été démontré que les caractéristiques respiratoires des mitochondries sur fibres perméabilisées étaient similaires à celles obtenues sur mitochondries isolées [13]. De plus, les quantités tissulaires nécessaires sont nettement plus réduites puisque 20mg de fibres musculaires en l'occurrence suffisent pour plusieurs expériences oxymétriques. Le bénéfice pour le patient, en particulier le patient pédiatrique, est évident. Dans notre étude, nous avons été obligés de faire des prélèvements plus importants afin de pouvoir couvrir toutes les analyses : oxymétrie, biochimie, etc.

      L'intégrité structurelle des mitochondries est vérifiée par un test assez simple, le test au cytochrome C. Dans des conditions idéales, la membrane externe de la mitochondrie est intacte et le cytochrome C reste dans l'espace intermembranaire. Un apport artificiel de cytochrome n'a alors aucun effet sur a courbe respiratoire. Lorsque la membrane n'est plus imperméable comme cela peut arriver avec un traitement trop agressif à la saponine, le cytochrome C se dilue dans le cytosol. A ce moment là, du cytochrome C apporté artificiellement s'incorpore à la membrane mitochondriale et stimule la respiration de plus de 5% (Wolfram Kunz, données non publiées).

      La perméabilisation des fibres musculaires présente ainsi un net avantage par rapport à l'isolation des mitochondries. La technique est décrite dans ce qui suit.

      Une fois prélevé, le muscle est disséqué aussi délicatement et aussi rapidement que possible dans un bain de Biops à 5°C (cf. composition plus loin). L'un des problèmes de l'oxymétrie sur fibres musculaires est la diffusion de l'oxygène entre le milieu d'expérimentation et les fibres d'une part et d'autre part la diffusion qui existe entre le milieu et la membrane semi-perméable placée sur l'électrode ainsi que celle entre cette membrane et l'électrode elle-même. Toutes ces composantes sont exprimées dans une constante de temps t (tau) pouvant être déterminée par une manoeuvre de calibration (" stirrer test ") comme expliqué dans la partie technique de cette étude.

      La dissection est effectuée à la loupe binoculaire d'abord en gros paquets de fibres. Ces paquets sont secondairement plus finement disséqués de manière à finalement obtenir des paquets de 7 à 10 fibres maximum. Ces fibres sont stockées avant perméabilisation dans du Biops.

      La perméabilisation ou " saponification " consiste à créer des pores dans les membranes sarcolemmales de façon à permettre une pénétration des substrats et des inhibiteurs utilisés dans les expériences oxymétriques. La saponine a cette particularité de s'attaquer spécifiquement aux membranes phospholipidiques riches en cholestérol, ce qui n'est pas le cas des membranes mitochondriales : on ne perméabilise que les membranes des cellules musculaires [18]. La spécificité de cette action est cependant dépendante du temps : plus la fibre est exposée à la saponine, plus elle risque de présenter une altération de ses mitochondries (cf. fig. 3). Une courbe flux d'oxygène versus temps de saponification permet de détecter le temps optimal d'exposition à la saponine. Un premier groupe de plusieurs paquets d'environ 7 fibres est plongé dans un tube Eppendorf 1.5ml rempli d'une solution de saponine 50mg/ml dans du Biops. Ce tube est agité durant le temps optimal de perméabilisation sur un microshaker (MS, Mika ). Il est primordial d'utiliser un agitateur de bonne qualité avec une agitation très régulière et constante. A la fin du temps de perméabilisation, l'échantillon est plongé successivement pendant dix minutes dans deux tubes d'un bain de stockage constitué notamment d'albumine bovine (mitomed 1) permettant de stopper la réaction avec la saponine. L'albumine a également pour fonction de protéger les fibres et leurs mitochondries de l'effet des protéases libérées par le muscle.

      Les fibres sont maintenant prêtes pour une expérience oxymétrique.

      

Fig. 3 : Courbe de saponine effectuée sur des fibres du muscle deltoïde d'un sujet sain.

      Les fibres sont soumises à divers temps d'exposition à la saponine (abscisse). Le temps optimal de perméabilisation permettant une consommation maximale d'O2 (ordonnée) est ainsi déterminé sur la courbe (entre 25 et 30 minutes).


3.2 L'appareil oxygraphique (cf. fig 4.)


3.2.1 Description des composants

      L'oxymètre ou oxygraphe que nous avons utilisé, dessiné et conçu par Paar en Autriche, se compose d'une unité de mesure et d'une unité de contrôle. L'unité de contrôle, qui n'est pas représentée sur la figure 4, est un bloc électronique nous permettant de régler certains paramètres expérimentaux tels que la vitesse de rotation des barreaux magnétiques, la température d'incubation. C'est également dans cette unité de contrôle que sont traitées les informations transmises par l'unité de mesure. L'unité de mesure est un monobloc dans lequel deux chambres de mesure en verre (duran polished glass) sont placées l'une à côté de l'autre thermiquement isolées par une couche de polystyrène expansé (cf. fig. 4). Chaque chambre est en contact à sa base avec une électrode à oxygène type " électrode de Clark ". Le milieu d'expérimentation est agité par un barreau magnétique entouré de polyéthylène (PEEK) mu par quatre électro-aimants placés sous la base de chaque chambre en verre. Un thermorégulateur ou thermostat de haute précision permet un contrôle précis et constant de la température d'expérimentation.

      Les chambres sont scellées par deux pistons dont le fond est constitué de titane et possédant en leur centre un orifice capillaire. Ceci permet d'obtenir un espace fermé dans lequel on peut tout de même injecter les substrats et les inhibiteurs grâce à des seringues de haute précision (seringues de Hamilton). Il est primordial que tous les joints et les matériaux en contact avec le milieu d'expérimentation (chambre en verre, mélangeur, fond des pistons) soient totalement inertes vis-à-vis de l'oxygène afin de minimiser les phénomènes d'absorption et de relarguage (" backdiffusion ") à hautes et basses concentrations d'oxygène respectivement. Ces deux types de phénomènes peuvent être corrigés par une calibration effectuée par titration à l'oxygène (cf. fig. 5). Lorsqu'ils deviennent trop importants, les mesures oxymétriques sont ininterprétables.

      

Fig. 4 : Electrode de Clark


3.2.2 L'électrode de mesure (cf. fig. 4)

      Il s'agit d'un système comprenant une cathode (pôle négatif) en or entourée d'une anode (pôle positif) en argent. La cathode est étroitement en contact avec la membrane semi-perméable de tefcel (dérivé du téflon). L'oxygène diffuse à travers elle et est réduit en H2O au niveau de la cathode :

      O2 + 4H+ + 4e- = 2H2O

      Le circuit se termine au niveau de l'anode en argent qui est lentement oxydée par le KCl :

      Ag + Cl- = AgCl + 1e-

      Ce processus dépend, comme déjà mentionné, de la distance de diffusion entre le milieu d'expérience et l'électrode. Cependant d'autres facteurs entrent en jeu comme la température, la viscosité du milieu d'expérience, l'épaisseur et la perméabilité de la membrane, la vitesse de rotation du barreau magnétique.

      La réduction de l'oxygène en H2O est un processus qui consomme lui-même de l'oxygène. Ceci signifie que le signal du flux d'O2 mesuré représente la somme des consommations du système de mesure (électrode) et du système biologique (fibres musculaires perméabilisées). Le " background " ou " calibration " permet de mesurer la consommation en O2 du système de mesure.


3.2.3 Calibration des flux d'oxygène

      La calibration du système, c'est-à-dire la détermination de ses propriétés de base, doit être effectuée aussi fréquemment que possible. En effet, ces propriétés peuvent changer rapidement même sur des périodes aussi courtes que quelques heures. Le problème majeur sur ces petits intervalles de temps est la contamination bactérienne qui peut se traduire par une consommation anormalement élevée d'oxygène. Afin d'éviter ceci, nous remplissons régulièrement les chambres de verre avec de l'alcool 70% et laissons tourner l'appareil pendant une vingtaine de minutes afin de les désinfecter.

      Nous avons déjà mentionné que pour mesurer un flux, le système consomme de l'oxygène. La "  backdiffusion " d'O2 à basses concentrations est un autre phénomène qui a son importance. Dans le but de minimiser ce phénomène, il est important de choisir des matériaux possédant une perméabilité minimale à l'oxygène. Ainsi des matières telles que le plexiglas et le téflon sont à proscrire. La calibration nous permet donc de vérifier la fiabilité des mesures oxygraphiques mitochondriales dans les conditions expérimentales.

      Plusieurs méthodes sont à disposition pour effectuer une calibration, comme par exemple l'utilisation de produits chimiques tels que l'hydrosulfite de sodium. Nous avons opté pour une autre méthode peut-être un peu moins précise, mais techniquement plus simple aussi. Elle consiste à faire une titration à l'argon (Ar), gaz lourd qui se substitue à l'oxygène dans la chambre d'expérimentation. Après avoir fermé les chambres d'expérimentation, les variations barométriques de l'air n'ont plus d'influence sur la calibration et seule la pression partielle d'O2 dans l'air au départ (en équilibre avec l'air) est prise en compte pour le calcul de la concentration d'O2 dans le milieu d'expérimentation. D'autres facteurs tels que la température, la saturation en vapeur d'eau de l'air sont pris en compte par l'unité de contrôle de l'appareil pour calculer la concentration d'O2 (CO2) dans le milieu et la relation finale entre tous ces facteurs est :

      CO2 = C * (pb- pH2O) / {(101.325-pH2O)*0.20946} * Fm

      C = conc. d'O2 dans l'eau en l'équilibre avec l'air à 760mmHg. pb = pression barométrique. pH2O = pression de la vapeur d'eau dans l'air. Fm = facteur de solubilité de l'oxygène dans un milieu m donné. La solubilité de l'oxygène (et Fm) diminue avec la salinité du milieu.La température intervient dans le calcul de pH2O.

      Nous utilisons un milieu d'expérience composé de mannitol, KCl et de chélateurs ioniques (cf. " Milieux d'expérimentation, substrats et inhibiteurs "). Le facteur de solubilité de ce milieu est estimé à 0.9 (Fm mitomed 2, tel que donné sur une table fournie par les concepteurs de ce milieu).


3.2.4 Protocole de calibration

      Chaque fois que l'on change un paramètre du système nous effectuons une calibration. On met en route l'oxygraphe rempli du milieu d'expérimentation. Après avoir baissé les pistons, nous attendons la stabilisation du signal, ce qui peut souvent prendre une vingtaine de minutes (fig. 5a).

      

Fig. 5a : Courbe d'oxygène lors d'une calibration. Le signal de consommation d'O2 est représenté sur la figure x.

      Close : fermeture du piston.

      1 à 4 : paliers de titration O2. Le premier (1) apparaît après la fermeture (close) et représente la consommation du système à 100% d'O2. Les autres sont crées artificiellement par injection d'Argon (R).

      Pour obtenir une déplétion totale en O2, nous injectons dans la chambre des myoblastes stimulés ensuite par des substrats (Myoblasts). Remarquer la valeur de conc. O2 avant et après. Noter aussi l'artéfact provoqué par l'entrée d'une faible quantité d'oxygène lors de l'injection des myoblastes.

      Par la suite, trois ou mieux quatre paliers différents de vingt minutes environ sont produits par injection d'Argon dans les deux chambres. Finalement, pour atteindre la valeur de concentration d'O2 la plus basse, on utilise des myoblastes produits en culture que l'on stimule (stade 3 de la respiration, cf. table 4) au moyen des substrats adéquats. La dérivation du tracé de la courbe de concentration d'oxygène dans la chambre oxygraphique lors de la calibration est représenté dans la figure 5.b et correspond à la consommation d'oxygène en fonction du temps.

      

Fig. 5b : Courbe de signal (consommation O2) de la figure x.

      R : Argon. 1 à 4 : signaux (soulignés en bleu) correspondants aux paliers d'O2 de la figure x.

      Chaque injection (Argon, Myoblastes et Substrats) provoque un artéfact dû à la diminution rapide d'O2 dans la chambre.

      Noter la respiration des myoblastes, puis leur épuisement à des concentration d'O2 proches de 0%

      Le programme Datlab 2.1 permet l'analyse des datas. On obtient ainsi la relation entre la consommation d'oxygène par le système et la concentration d'oxygène. Cette relation est linéaire (fig. 5c) et peut donc être représentée par l'équation :

      y = a0 + b0 * x

      L'intersection de cette droite avec l'ordonnée (a0) correspond à la consommation d'O2 du système dans des conditions de déplétion totale en oxygène. Cette valeur doit être située entre -1 et -2 pmol/sec/cm3 (cf. fig. 5c) pour que les mesures oxygraphiques soient fiables. Lorsque l'on dépasse cette limite de plus de 1 pmol/sec/cm3, soit dans un sens soit dans l'autre, un contrôle soigné de l'appareil est nécessaire. Si la consommation dépasse -3 pmol/sec/cm3 (c'est-à-dire de -3 à -) à une concentration de 0% O2, on doit suspecter une perte d'imperméabilité du système à l'oxygène de l'extérieur ou une " backdiffusion " trop importante due à l'emploi d'un matériau relarguant de l'oxygène par exemple. Si au contraire, elle est entre -1 et 0 pmol/sec/cm3, il faudra suspecter une contamination bactérienne. Une valeur plus grande que 0 pmol/sec/cm3 est théoriquement impossible à une concentration de 0% O2 à moins qu'il y ait une erreur mathématique. La pente de cette droite (b0) est idéalement de 0.025.

      

Fig. 5c : Courbe de calibration où la valeur d'intersection a0= -1.92 et la pente de la droite b0 = 0.021 selon la relation y = a0 + b0 * x


3.2.5 Constante de temps t (tau)

      La constante de temps nous donne une indication de la vitesse de réponse de l'électrode. En général elle est augmentée lorsque la membrane est défectueuse, par exemple mal adaptée avec une couche trop importante d'électrolyte entre elle et la cathode ou alors lorsqu'elle est contaminée par de la graisse servant à étanchéifier les joints en caoutchouc. Bien entendu, elle peut également être augmentée par une électrode altérée.

      Il existe une méthode très simple pour évaluer tau, c'est le test du mélangeur ou " stirrer test ". Lorsque l'on arrête le mélangeur, on perd l'homogénéité du milieu d'expérimentation et la concentration d'oxygène diminue rapidement à proximité de l'électrode qui continue à consommer de l'oxygène (cf. fig 6) ce qui se traduit par une chute de la courbe de concentration sur l'écran. Au redémarrage, l'électrode répond normalement selon une courbe exponentielle définie par l'équation :

      yt = A + b * exp(-t/t)

      La constante de temps tau est le temps nécessaire pour atteindre le 63% de la réponse (cf. fig. 6). Techniquement, sur un stirrer test, on considère comme exponentiel seulement la partie de la courbe située entre 50 et 75% de réponse, le début étant perturbé par le redémarrage du mélangeur. Une valeur pour tau située entre 4 et 6 secondes est suffisante pour nos expériences où l'on n'étudie pas la cinétique rapide de la consommation d'oxygène.

      

Fig. 6 : aspect d'un stirrer test sur une courbe d'oxygène et permettant l'estimation de la constante de temps, tau.Trois marques sont nécessaires pour cela, O2% initial ou 0%

      La vitesse du mélangeur n'affecte que peu t contrairement à la température qui en s'élevant diminue linéairement sa valeur. Intuitivement, ceci est en accord avec le processus de diffusion : ce dernier est facilité par des températures plus élevées puisque la viscosité du fluide diminue.


3.3 Milieux d'expérimentation, substrats et inhibiteurs


3.3.1 Milieux de transport, de préservation et d'incubation

      Le Biops est un milieu de relaxation pour les fibres musculaires dans lequel elles sont plongées immédiatement après le prélèvement. Nous les préservons ensuite et les disséquons dans ce milieu qui reste à 5°C environ (glace mouillée). La composition du Biops est détaillée dans la table 1.

      
Tabl. 1 : Composition du Biops
Composé Conc. Finale      
CaK2-EGTA 2.77 mM      
K2-EGTA 7.23 mM      
Na2-ATP 5.7 mM   Ca++ libre 0.1 mM
MgCl2 6H2O 6.56 mM   Mg++ libre 1 mM
Taurine 20 mM   MgATP 5 mM
Na2-PCréatine 15 mM   force ionique 160 mM
Imidazole 20 mM      
Dithiothreitol 0.5 mM      
MES 50 mM      

      Il faut retenir plusieurs éléments de la composition de ce milieu. D'abord la grande quantité de chélateurs qui permettent de maintenir la concentration libre de calcium à un maximum de 0.1 mM, c'est-à-dire proche de la concentration physiologique intracellulaire. On empêche ainsi un éventuel flux calcique intracellulaire qui pourrait générer une contraction de la fibre musculaire et donc un épuisement des réserves énergétiques, en particulier mitochondriales, ce qui se traduirait finalement en oxygraphie par une respiration diminuée ou altérée. Egalement dans le but d'éviter un épuisement mitochondrial, l'ATP (Mg-ATP) maintient une activité ATPase, notamment myosine-ATPase. Il faut aussi se rappeler que les fibres sont préservées à 5° C de telle manière à ralentir leurs processus métaboliques et maintenir fonctionnelles le plus longtemps possible leurs mitochondries.

      Après saponification, les fibres sont plongées dans un bain de mitomed 1 (cf. table 2) contenant de la BSA pour stopper la réaction avec la saponine. Elles sont stockées dans ce milieu en attendant les mesures d'oxygraphie.

      
Tabl. 2 : Composition du Mitomed 1
Composé Conc. finale      
EGTA 0.5 mM      
MgCl2 6H2O 3 mM      
Taurine 20 mM   Ca++ libre 0.0 mM
KH2PO4 10 mM   Mg++ libre 2.07 mM
HEPES 20 mM   EGTA libre 0.44 mM
Sucrose 200 mM   force ionique 34 mM
BSA 1 g/l      

      A constater l'absence de calcium libre dans le mitomed 1 et la présence de BSA. Ce milieu peut aussi être utilisé comme milieu d'expérimentation, en particulier avec des mitochondries isolées.

      Le milieu d'expérimentation que nous utilisons pour les mesures oxygraphiques est le mitomed 2 (table 3). Ce choix s'explique notamment par l'absence de BSA qui pourrait fausser nos mesures de contenu protéique des fibres, mesures utilisées pour la normalisation des flux respiratoires.

      
Tabl. 3 : Composition du Mitomed 2
Composé Conc. finale      
Na2-EDTA 0.5 mM      
MgCl2 6H2O 5 mM   Ca++ libre 0.0 mM
KH2PO4 10 mM   Mg++ libre 3.1 mM
Mannitol 110 mM   EDTA libre 0.32 mM
KCl 60 mM   force ionique 116 mM
Tris 60 mM      


3.3.2 Substrats

      Différents substrats sont à disposition selon le type d'expérience oxygraphique que l'on veut mener. Nous définissons ces substrats en fonction des complexes qu'ils vont stimuler.

  • Pyruvate
    Acide pyruvique (C3H3O3Na), FW (Poids Mol.) 110, concentration de la solution stock à 1M. Doit être préparé à partir de la poudre pour chaque expérience en raison de son instabilité.
    Substrat du Complexe I (NADH déhydrogénase)
  • Malate
    Acide L-malique (C4H6O5), FW 134.1, solution stock à 1M.
    Active le cycle de Krebs en augmentant la disponibilité d'oxaloacétate.
  • Glutamate
    Acide L-glutamique (C5H8NO4Na), FW 187.1 (hydreux) ou FW 169.1 (anhydreux), solution stock à 1M.
    Substrat du Complexe I (NADH déhydrogénase).
  • ADP
    Adénosine 5'diphosphate (C10H15N5O10K), FW 491.2 ou FW 427.2 (acide libre). Solution stock à 500mM. Sensible à la lumière et à la chaleur (transformation en AMP).
    Activateur du stade 3 de la respiration (saturation en substrats et ADP).
  • Succinate
    Acide succinique (C4H4O4Na2 6H2O), FW 270.1, solution stock à 1M.
    Substrat du complexe II (Succinate déhydrogénase, SDH).

3.3.3 Inhibiteurs

      Différents inhibiteurs sont utilisés. Pour des raisons pratiques de calcul des coefficients de contrôle, nous n'utilisons que des inhibiteurs réversibles. Il existe donc un équilibre entre la forme liée au complexe et la forme libre selon la formule :

      E + I D EI

      L'équilibre est défini par une constante d'équilibre Kd dont nous devons tenir compte dans le calcul des coefficients de contrôle (cf. Analyse du Contrôle Métabolique). Tant que les concentrations d'inhibiteur restent situées en dessous de cette Kd, nous sommes certains d'avoir un effet spécifique sur le complexe étudié. Dans une titration par inhibiteur, la région définie par une concentration plus basse que la valeur de Kd est appelée " domaine non-limitant de l'enzyme ".

      Nous testons les activités respiratoires de deux complexes en particulier, car plus fréquemment touchés dans les mitochondriopathies d'après la litérature [1]. Ce sont les Complexes I et IV (NADH déhydrogénase et Cytochrome c oxydase). Les inhibiteurs respectifs que nous avons utilisés sont l'amytal et l'azide.

  • Amytal
    Amobarbital (C11H17N2O3Na), FW 248.3, solution stock à 200mM. Sensible à la lumière. A diluer dans de l'éthanol 50%.
    Inhibiteur spécifique du Complexe I (NADH déhydrogénase).
  • Azide
    Azide de sodium (NaN3), FW 65, solution stock à 1M. Substance très toxique.
    Inhibiteur spécifique du Complexe IV (Cytochrome c oxydase).

3.4 Expérimentation

      Comme nous l'avons déjà souligné, les complexes les plus fréquemment touchés par les anomalies génétiques mitochondriales sont la NADH Déhydrogénase (Complexe I) et la Cytochrome C Oxydase (Complexe IV). Notre choix dans le test fonctionnel mitochondrial par oxymétrie s'est donc porté sur ces deux enzymes, mais il s'est aussi fait pour des raisons techniques. En effet, la respirométrie est une méthode à très grande inertie. La dissection des fibres se fait en un peu moins de deux heures, la saponification prend trente minutes et les expériences elles-mêmes, en comptant les intervalles nécessaires à la stabilisation du signal, prennent chacune de une heure à une heure et demie. En tout, ceci représente entre six à huit heures d'occupation sans relâche pour trois types de mesures, le flux maximum, la titration du complexe I et la titration du complexe IV.

      Plusieurs autres difficultés techniques expliquent également notre choix limité, comme par exemple le caractère irréversible des inhibiteurs des autres complexes de la chaîne respiratoire, ce qui oblige l'expérimentateur à déterminer sur la courbe la concentration nécessaire pour l'inhibition maximale Imax afin de pouvoir calculer les coefficients de contrôle [31].

      Les paramètres expérimentaux étaient les suivants dans les trois types de mesures effectuées : milieu d'expérimentation sans BSA (Mitomed 2), volume de la chambre 2.0ml, température 30°C, concentration d'oxygène de 200mM environ. Les résultats publiés par les autres groupes intéressés à l'oxygraphie humaine avaient été obtenus à 25°C. A cette température, certains processus enzymatiques liés notamment à l'ischémie du tissu expérimental sont réduits. Le désavantage réside dans le fait que l'on se trouve loin de la température physiologique de 37°. Actuellement pourtant, les milieux de préservation et d'expérimentation pourraient permettre de monter la température expérimentale à 37°C (Kuznetsov, non publié). Toutefois à cette température survient une fuite protonique plus importante à travers la membrane mitochondriale. Les mesures doivent dès lors être interprétées plus prudemment. Nous avons donc choisi une température de 30°C qui est intermédiaire et qui a également été utilisée avec succès par d'autres groupes de recherche [16, 22]. Elle est plus physiologique que 25°C, sans présenter les inconnues actuelles de la température physiologique de 37°C.


3.4.1 Flux maximal d'O2 (ou Consommation maximale)

      L'une des façons d'évaluer la capacité métabolique mitochondriale consiste à mesurer le niveau de consommation maximale d'oxygène par unité de temps normalisé au poids de l'échantillon de fibres (nmolO2/min/mgprot). Nous avons pu mettre en évidence que ce flux maximal variait énormément malgré notre méthode de normalisation aux protéines non-collagéniques (cf. résultats).

      Protocole

      Glutamate 10mM et malate 5mM concentrations finales dans les chambres. Attente de stabilisation du signal. Addition d'ADP 1mM concentration finale. Attente de stabilisation du signal. Addition de succinate 10mM concentration finale. Attente de stabilisation de signal.

      Théoriquement, la respiration avec le pyruvate ne doit pas être significativement différente de celle avec le glutamate. Si une telle différence se révèle, il faut suspecter une anomalie de l'activité enzymatique de la Pyruvate Déhydrogénase (PDH).


3.4.2 Test fonctionnel du Complexe I (NADH Déhydrogénase)

      Une autre façon d'étudier le métabolisme mitochondrial est la détermination des réserves énergétiques de la mitochondrie par titration avec un inhibiteur. Cette stratégie nous permet de calculer ensuite un " coefficient de contrôle " du complexe inhibé (cf. Analyse du Contrôle Métabolique). Il s'agit d'effectuer une courbe dose-réponse de l'activité enzymatique. Pour le premier complexe de la chaîne mitochondriale, l'inhibiteur utilisé était l'amytal (cf. fig. 7)

      Protocole

      Glutamate 10mM et malate 5mM concentrations finales dans les chambres. Addition d'ADP 1mM concentration finale (stade 3 de la respiration). Attente de stabilisation du signal pendant au moins 15 minutes.

      Titration Amytal comme suit (en concentrations finales dans la chambre) :

      -> 25mM, 62.5mM, 125mM, 187.5mM, 312.5mM, 562.5mM

      

Fig. 7 : exemple de titration à l'Amytal de la fonction de la NADH Déhydrogénase (Complexe I).

      Les plateaux (en bleu) sont obtenus par l'addition de doses croissantes d'inhibiteur (B = amytal).

      Le premier plateau d'activité oxydative représente Jmax, le flux maximal respiratoire mitochondrial au stade 3 de la respiration pour une dose nulle d'inhibiteur (I0) sous l'effet du glutamate.

      Nous avons utilisé comme valeur de Kd pour l'amytal celle déterminée à 25°C (Kd=170mM) et employée par d'autres laboratoires de recherche [29].

      La prudence était de mise lors de l'attente de stabilisation après injection des différents substrats en raison d'une activation lente de la Glutamate Déhydrogénase (GDH). Cet effet est plus marqué avec la Pyruvate Déhydrogénase (PDH) rendant difficile une titration aux inhibiteurs.


3.4.3 Test fonctionnel du Complexe IV (Cytochrome c Oxydase)

      Pour la titration de ce complexe nous avons utilisé l'azide. La stimulation de la respiration au stade 3 (= en présence d'ADP) est obtenue par l'addition de succinate au glutamate (cf. fig. 8).

      Protocole

      Glutamate 10mM et malate 5mM concentrations finales dans les chambres. Addition d'ADP 1mM concentration finale, puis succinate 10mM concentration finale. Attente de stabilisation du signal pendant au moins 15 minutes.

      Titration Azide comme suit (en concentrations finales dans la chambre) :

      -> 12.5mM, 31.25mM, 62.5mM, 93.75mM, 156.25mM, 281.25mM

      

Fig. 8 : exemple de titration à l'Azide de la Cytochrome c Oxydase (Complexe IV).

      Les plateaux (en bleu) sont obtenus par l'addition de doses croissantes d'inhibiteur (N = azide).

      Comme pour la figure précédente, le premier plateau représente le Jmax au stade 3 de la respiration, mais cette fois-ci sous l'effet des substrats glutamate et succinate pour une dose nulle d'inhibiteur (I0).

      Nous avons utilisé comme valeur de Kd pour l'azide celle déterminée à 25°C (Kd=64mM) et employée par d'autres laboratoires de recherche [29] [30].


4. Autres méthodes


4.1 Méthode de mesure de protéines


4.1.1 Le choix de la méthode

      Un coefficient de contrôle est une mesure quantitative non rattachée à une unité ce qui a été démontré mathématiquement précédemment. La consommation d'oxygène d'une mitochondrie, c'est-à-dire sa respiration, dépend de divers paramètres énumérés dans la table 4 [23]. La difficulté principale rencontrée par les différents groupes ayant étudié le métabolisme de la chaîne respiratoire mitochondriale au moyen d'un oxygraphe a été la détermination d'une unité de référence à laquelle ils pouvaient ensuite rapporter les valeurs expérimentales de respiration maximale.

      
Tabl. 4 : [Conditions limitant la respiration selon les stades]
  Conditions limitant la respiration
Stade I Disponibilité en ADP et en substrats
Stade II Disponibilité en substrat seul
Stade III Substrats et Composants en saturation
Stade IV Disponibilité en ADP seul
Stade V Disponibilité en Oxygène seul

      Il est possible de rapporter les valeurs expérimentales de consommation d'oxygène au stade III à l'activité de la citrate synthase (CS), enzyme exclusivement intramitochondriale. Cette méthode est actuellement progressivement adoptée par certains groupes d'étude.

      Deux autres méthodes plus rapides mais nettement moins précises sont la mesure du poids humide " tamponné " et du poids sec des fibres musculaires utilisées lors de chaque séance expérimentale [13, 17] . Ces méthodes sont sujettes à beaucoup de biais dont le principal est la mauvaise reproductibilité du " tamponnage ". Le poids est déterminé sur une balance de haute précision, mais très sujette aux perturbations par des facteurs extérieurs. La reproductibilité peut être évaluée en calculant le rapport poids humide/poids sec qui devrait donc rester constant. Le poids sec est obtenu en incubant les fibres musculaires récupérées après l'expérience dans une étuve à 40°C pendant une nuit.

      La reproductibilité des mesures de poids sec et humide ne nous a pas semblé satisfaisante. Par ailleurs, après une période de mise au point par le responsable de projet, les mesures devaient également être effectuées par un autre collaborateur ce qui signifiait la nécessité d'établir une seconde courbe d'apprentissage. Nous avons donc cherché un moyen facilement reproductible nous permettant de " normaliser " les valeurs mesurées de consommation d'oxygène, c'est-à-dire rapporter une mesure exprimée par l'oxymètre en picomoles d'O2/min à une valeur spécifique à chaque groupe de fibres utilisées lors des séances expérimentales. L'un des problèmes dans cette approche était qu'une partie inconstante des fibres plongées dans l'oxymètre finissait par être mécaniquement broyée et dissoute dans le milieu d'expérimentation, raison pour laquelle il était ensuite difficile et certaines fois impossible de déterminer le poids sec en récoltant les fibres en fin d'expérience.

      Les fibres musculaires contiennent une faible proportion de protéines collagéniques. D'autre part, les protéines non collagéniques sont plus facilement dissociables en acides aminés par des procédés chimiques et mécaniques que les protéines collagéniques dont les nombreuses liaisons covalentes intermoléculaires sont très puissantes.

      Nous sommes partis du principe que chaque fibre musculaire disséquée selon notre protocole d'étude possède une certaine proportion de protéines non collagéniques mesurable par la réaction du biuret, méthode peu sensible au départ, mais dont le pouvoir de détection fut nettement amélioré par l'utilisation du réactif de Folin [32]. Sans entrer dans les détails, la réaction du biuret consiste en la réduction d'un atome de cuivre Cu++ en Cu+ par la protéine dans un milieu alcalin. Le complexe ainsi créé vire à la couleur bleue pouvant être mesurée au spectrophotomètre.

      La sensibilité de détection de l'atome de cuivre réduit (Cu+) a ensuite été augmentée par l'addition d'acide bicinchoninique (Bicinchoninic Acide ou BCA) créant un complexe BCA-Cu+ qui vire à la couleur pourpre plus ou moins intense selon le contenu en acides aminés de la protéine analysée et le nombre de liaisons peptidiques. Cette intensité de couleur est analysée par spectrophotométrie d'absorption à une longueur d'onde égale ou proche de 562nm. Les autres avantages représentés par cette méthode sont une plus grande facilité technique, des courbes d'étalonnage plus linéaires, une grande flexibilité dans le protocole expérimental. De plus, la caractéristique qui nous a paru la plus intéressante a été la possibilité d'éliminer la majeure partie des interférences en précipitant les protéines à analyser par de l'acide trichloracétique ou TCA. Elles peuvent être ainsi récupérées et resolubilisées dans un mélange de détergent et de NaOH (SDS-NaOH) pour être ensuite soumises au réactif BCA [33].

      Nous avons donc décidé de normaliser les valeurs de consommation maximale d'oxygène (pmolO2/min) au contenu en protéines non collagéniques de chaque groupe de fibres musculaires disséquées lors de chaque séance expérimentale.


4.1.2 Description du Protocole de Mesure de Protéines

      Le protocole original fut modifié et adapté à notre protocole d'étude oxymétrique en collaboration avec le Département de Biochimie du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV).

      Il faut se rappeler qu'à la fin de chaque mesure oxymétrique nous nous retrouvons avec des fibres musculaires encore entières et, de façon inconstante, avec une proportion plus ou moins grande dissoute dans le milieu expérimental. Nous récupérons systématiquement à la fois les fibres et les 2.18 ml du milieu d'incubation. Le tout est centrifugé pendant 5 minutes à 3000g, le surnageant est aspiré à la pipette et mis de côté pour une mesure ultérieure de concentration en protéines par la méthode BCA. Les fibres musculaires sont re-suspendues dans 1 ml de PBS (Phosphate Buffer Solution) et re-centrifugées pendant 5 minutes à 3000g. Le surnageant de PBS est aspiré et jeté. Nous avons donc d'un côté des fibres musculaires isolées et de l'autre 2.18 ml de milieu expérimental contenant une proportion plus ou moins importante de protéines dissoutes.


4.1.2.1 Procédure pour le Milieu d'Incubation

      Prendre 100ml du premier surnageant (a) récupéré et qui représente un échantillon du milieu d'incubation (milieu expérimental). Rajouter 900ml de H2O(dd), 100ml de Na-déoxycholate à 0.15% et 100ml de TCA à 72%. Le Na-déoxycholate est un détergent permettant de solubiliser les protéines.

      On poursuit par une centrifugation 10minutes à 15000g. Aspirer le surnageant (b). Le TCA permet ici de précipiter les protéines suspendues. Si des fibres ont effectivement été dissoutes durant l'expérience d'oxymétrie, leurs protéines non-collagéniques seront visibles sous la forme d'un précipitat blanc que l'on va donc récupérer et resuspendre dans 100ml de 1% de SDS dans NaOH à 1N.


4.1.2.2 Procédure pour les Fibres Musculaires

      Les fibres musculaires récupérées en fin d'expérimentation oxymétrique doivent être broyées mécaniquement d'abord dans un Eppendorf 1.5ml dans lequel on ajoute 200ml de 1% de SDS dans NaOH à 1N. Lorsque les fibres sont finement broyées, centrifuger 5 minutes à 15000g. Aspirer le surnageant et diluer dans 200ml de 1% de SDS dans NaOH à 1N. On obtient ainsi un volume total de 400ml.

      Matériel pour la méthode BCA

      
Réactif BCA disponible chez Pierce® Réactif A #23223
Réactif B #23224
Microplaques 96 puits (250ml) disponible chez Falcon® Réf. #353072
Solution BSA d'étalonnage disponible chez Biorad® BSA #500-0007

      La préparation du réactif BCA est détaillée dans le mode d'emploi fourni avec le matériel.

      Spectrophotométrie et Logiciel d'Analyse

      Logiciel "Genesis version 1.65" de Labsystems®. Ce programme nous permet de calculer la concentration de protéine (mg/ml) contenu dans les puits de la microplaque et mesurée dans un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 562nm.

      Préparation de la Microplaque 96 puits

      La plaque est constituée de 12 colonnes et 8 lignes et donc 96 puits. Les puits peuvent contenir chacun un volume de 250ml au maximum. La disposition des " blancs ", des valeurs de la courbe standard et des solutions à tester se fait selon la table 5. Les mesures se font toujours en triplets. La solution BSA standard mère (en général 1.49mg/ml) est diluée successivement de manière à obtenir les concentrations connues suivantes et qui serviront à calculer la courbe standard : 745mg/ml à 11.6mg/ml, colonnes 3, 4 et 5 sur la table 5.

      Les puits pour la courbe standard sont remplis de 25ml de BSA de chaque dilution de la solution mère et de 25ml du tampon 1% SDS dans NaOH 1N.

      Les puits pour les blancs représentés par tous les diluants qui pourraient éventuellement interférer avec les mesures de spectrophotométrie sont remplis de 25ml H2O bidistillée et de 25ml de la solution tampon 1% SDS dans NaOH 1N. Leur valeur moyenne est ensuite calculée et automatiquement soustraite par le programme d'analyse à toutes les valeurs mesurées, valeurs standards et valeurs des inconnues (Ux).

      Les puits pour les valeurs inconnues à déterminer (Ux) sont remplis de 25ml H2O dd et de 25ml de solution à tester.

      Chaque puits est ensuite rapidement rempli au moyen d'une pipette à pointes multiples de 200ml du réactif de travail BCA.

      
Tabl. 5 : [Résultats de la microplaque]
  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Blanc Blanc 745 745 745 U1 U1 U1 U9 U9 U9  
B Blanc Blanc 372.5 372.5 372.5 U2 U2 U2 U10 U10 U10  
C Blanc Blanc 186.25 186.25 186.25 U3 U3 U3 U11 U11 U11  
D Blanc Blanc 93.125 93.125 93.125 U4 U4 U4 U12 U12 U12  
E Blanc Blanc 46.563 46.563 46.563 U5 U5 U5 U13 U13 U13  
F Blanc Blanc 23.281 23.281 23.281 U6 U6 U6 U14 U14 U14  
G Blanc Blanc 11.641 11.641 11.641 U7 U7 U7 U15 U15 U15  
H Blanc Blanc / / / U8 U8 U8 U16 U16 U16  

      Incubation de la Plaque

      La méthode BCA a originalement été développée pour détecter des concentrations de protéines situées entre 20 et 2000mg/ml en incubant la microplaque pendant environ 60 minutes à 30°C. On peut augmenter le seuil de détection de la méthode par une incubation de 30 minutes à 60°C. Elle est ainsi tout à fait fiable pour des concentrations situées entre 5 et 250mg/ml.

      Dans notre expérience, les courbes standard de BSA ont presque toujours été linéaires et fiables pour les concentrations dans lesquelles nous travaillions (concentrations entre les lignes B et G sur la table 5).


4.2 Biochimie

      Les analyses biochimiques ont été effectuées sous la responsabilité du Laboratoire Central de Chimie Clinique sur les biopsies musculaires des contrôles et sur celles des patients investigués. Ont été déterminés, lorsque le matériel de biopsie était suffisant, les activités spécifiques, exprimées en nmoles/min/mgprot non collagéniques, de la citrate synthase (CS), du Complexe I (NADH Déhydrogénase), du Complexe II partiel (succinate déhydrogénase = SDH), du Complexe II total, du segment II-III, du Complexe III (Cytochrome bc1) et du Complexe IV (Cytochrome C Oxydase). Par la suite, les activités des différents Complexes ont été exprimées par rapport à l'activité de la citrate synthase, enzyme du cycle de Krebs exclusivement intra mitochondriale. La quantité minimale nécessaire pour effectuer toutes les mesures était de 40mg.

      La méthode de mesure utilisée et que nous n'allons pas détailler ici était basée sur celle décrite par Birch-Machin et al. en 1994 [8]. La mesure des protéines non collagéniques s'est faite par la méthode de l'acide bicinchoninique selon un protocole modifié et décrit plus haut.


4.3 Histologie

      L'analyse histologique a été effectuée par le Dr G. Pizzolato (Département de Pathologie, HUG) pour toutes les biopsies. Le matériel envoyé frais le jour même du prélèvement était immédiatement traité et préparé pour différentes colorations. Les techniques de coloration employées comprenaient une coloration PAS et ORO afin de mettre en évidence les gouttelettes lipidiques, une coloration Gomori vert lumière permettant le cas échéant de voir des " ragged red fibres " (RRF), des colorations NADH (et/ou SDH) et ATPase afin de déterminer la répartition fibres de type I-fibres de type II ainsi qu'une éventuelle accumulation mitochondriale, et finalement une réaction à la cytochrome c-oxidase permettant de détecter un éventuel déficit de cet enzyme.

      

Fig. 9 : Exemple de coloration à la NADH permettant de distinguer la répartition fibres de type I, plus foncées, et fibres de type II, plus claires.

      On notera aussi les accumulations sous-sarcolemmales de mitochondries dans les fibres de type I correspondant aux zones très foncées. L'oeil exercé pourra déterminer si la répartition fibres I/II ainsi que les accumulations mitochondriales sont dans les limites de la norme ou non.

      Les colorations les plus relevantes ont été celles à la NADH et/ou SDH et à la cytochrome c-oxidase (cf. fig. 9, 10 et 11).

      

Fig. 10 : Exemple de coloration à la SDH permettant également de distinguer la répartition fibres de type I, plus foncées, et fibres de type II, plus claires.

      Ce muscle montre une accumulation inhabituelle de mitochondries sous-sarcolemmales.

      

Fig. 11 : Exemple de coloration pour la Cytochrome c-oxidase (Cox), enzyme mitochondriale que l'on retrouve surtout dans les fibres de type I.

      Dans un tissu musculaire normal, on ne trouve pas de fibres Cox négatives. Ici nous avons délibérément choisi de montrer une coupe histologique comprenant des fibres musculaires normales et d'autres qui sont négatives pour la Cox (blanches), comme nous aurions pu le voir chez un patient souffrant d'un trouble métabolique mitochondrial.

      Toutes ces colorations ont été systématiquement testées sur toutes les biopsies fournies au Département de Pathologie de la Faculté de Médecine. D'autres colorations supplémentaires ont parfois été effectuées dans certains cas sur lesquels nous reviendrons lors de la présentation des résultats.


4.4 Carnitine

      La carnitine est un co-transporteur des acides gras depuis l'espace intracellulaire vers les mitochondries et permet ainsi leur métabolisation lors de la b-oxydation. Il existe deux formes de déficit en carnitine.

      Le déficit primaire résulte d'un déficit du transport de carnitine [34]. Deux formes cliniques sont possibles : systémique et musculaire. Les manifestations cliniques de la maladie sont tributaires de l'équilibre entre le besoin fonctionnel et les réserves tissulaires. Il faut également noter que la concentration plasmatique en carnitine ne reflète pas l'état des réserves tissulaires. La forme systémique apparaît en moyenne à l'âge de deux ans et répond à un certain nombre de critères diagnostiques qui sont d'ailleurs les mêmes que pour la forme musculaire : (a) réduction sévère en carnitine plasmatique ou musculaire, (b) dysfonctionnement de l'oxydation des acides gras, (c) régression des symptômes lorsque le niveau de carnitine est restauré, (d) absence d'autres déficits primaires d'oxydation des acides gras [35].

      Dans la forme musculaire, celle qui nous intéresse, le déficit n'apparaît en général que durant la deuxième ou troisième décade de vie. Les patients présentent une faiblesse musculaire proximale progressive associée à une intolérance à l'effort, des myalgies et parfois une cardiomyopathie. La réponse au traitement de carnitine par voie orale est moins constante que dans la forme systémique [36].

      Le déficit secondaire en carnitine peut résulter de plusieurs autres pathologies systémiques provoquant un trouble du recyclage du CoA avec une accumulation de formes estérifiées de CoA. Les pathologies les plus fréquemment en cause sont les déficits génétiques d'enzymes de l'oxydation des acides gras dans la mitochondrie [35].

      Dans le cadre de cette étude, nous avons systématiquement fourni un morceau de biopsie musculaire au laboratoire du Prof. E. Girardin du Dpt. de Pédiatrie des HUG. La méthode décrite ci-dessous peut être utilisée pour déterminer la carnitine libre dans le muscle, la carnitine totale dans le plasma et dans l'urine. Le principe est basé sur la réaction suivante :

      L-carnitine + (1-14C)Acétyl- CoA D(1-14C)Acétyl-L-carnitine + CoASIL

      On dose l'Acétyl-L-carnitine qui a été séparée de l'Acétyl-CoA en excès par une résine échangeuse d'anions (Dowex 1-X10). La radioactivité de la (1-14C)Acétyl-L-carnitine est ensuite mesurée par un compteur et corrélée par stoichiométrie à la quantité de carnitine que l'on cherche [37]. Les résultats sont présentés plus loin.


4.5 Génétique mitochondriale

      De routine également, nous avons envoyé quelques milligrammes de muscle au Dpt. de Génétique Médicale des HUG (Dr. M. Morris) afin d'y faire effectuer un screening des mutations génétiques mitochondriales les plus fréquemment décrites dans la littérature (cf. table 6).

      
Tabl. 6 : Mutations génétiques mitochondriales les plus fréquemment décrites dans la littérature
Type d'analyse Mutation recherchée Technique Limitations
Southern Blot Délétions, duplications Digestion avec BamH1, électrophorèse sur gel 0.8%, transfert de Southern, hybridation avec ADNmt purifié Faux négatifs possibles: délétion très petite (< ;500 pb), mutation présente à < ;5% (hétéroplasmie)
PCR MELAS 3243 A-> ;G PCR de la région tRNA Leu (UUR), digestion avec Apa1 Faux négatifs: mutation présente à < ;5%
PCR MERRF 8344 A-> ;G PCR allèle-spécifique, détection en temps réel Faux négatifs: mutation présente à < ;5%
PCR NARP/Leigh 8993 C-> ;T PCR et digestion avec Hpa11 Très rare (actuellement abandonné du screening de routine)

      Pour les patients " contrôles ", ce screening est toujours revenu négatif, ce qui théoriquement n'exclut en rien qu'ils aient une mitochondriopathie fruste. En effet, comme indiqué dans le tableau, les faux négatifs sont possibles dans les situations où la délétion est trop petite ou lorsque le taux d'ADNmt muté est inférieur à 5%. Pour les besoins de l'étude, nous avons considéré tous les patients " contrôles " avec un screening mutationnel négatif comme " normaux ".

      Ce screening n'exclut pas les mutations au niveau de l'ADN nucléaire codant pour les autres sous-unités des complexes respiratoires mitochondriaux. Notre étude visait aussi à mettre en évidence tous les dysfonctionnements du métabolisme mitochondrial, et donc entre autres et surtout ces situations où le taux d'ADNmt muté est faible et indétectable par les méthodes d'investigation habituelles.


5. Analyse statistique


5.1 Oxygraphie 

      Le but de notre étude et de celles effectuées par d'autres groupes de recherche avant nous, était de comparer un patient isolé à une population de personnes définies comme " normales ". Dans cette optique on doit donc affirmer que la population " contrôle " qui représente un échantillon de la population " normale ", n'est constituée que de personnes ne présentant pas d'anomalies de leur métabolisme OXPHOS.

      Les publications précédentes employaient le Student's t-test pour leur analyse statistique [15]. Ce test permet de comparer deux populations paramétriques (distribution gaussienne) que l'on a auparavant définies. Les auteurs de ces études ont effectivement défini deux populations, l'une étant constituée par la moyenne des " coefficients de contrôle " déterminées chez des patients contrôles (valeurs " contrôles "). L'autre population était définie par la moyenne de plusieurs mesures effectuées pour déterminer le " coefficient de contrôle " chez un même patient. En réalité les auteurs n'ont donc pas effectué un t-test entre deux " vraies " populations différentes, mais entre une variable et une population. Nous avons choisi un autre type d'analyse.

      Au départ, nous avons un échantillon que l'on suppose être représentatif de la population " normale ". Pour savoir si cet échantillon suit une distribution normale ou non, nous pouvons effectuer un test de normalité. Si l'échantillon est effectivement représentatif de la population normale, on s'attend à ce que les points forment une ligne droite. Le choix d'un tel test repose sur le nombre (n) d'individus composant l'échantillon. Lorsque (n) est plus petit que 50, ce qui est le cas pour nos valeurs oxygraphiques de " contrôle ", le test de normalité le plus adéquat est celui de Shapiro-Wilks [38].

      Ce qui nous intéresse maintenant, c'est de vérifier si les coefficients de contrôle déterminés pour chaque patient " investigué " suivent cette distribution, auquel cas on pourra supposer qu'il n'y aucune raison qu'elles ne fassent pas partie de la population " contrôle ". Si les valeurs ne suivent pas cette distribution, on pourra suspecter un éventuel dysfonctionnement du métabolisme mitochondrial. Concrètement, il s'agit de refaire un test de Shapiro-Wilks pour chacune de ces valeurs en déterminant leur probabilité d'être similaire à la population " contrôle ". Cette probabilité est quantifiée par la valeur " sigma " que l'on peut assimiler au " p ". Plus son " sigma " est proche de 1, plus il devient probable que la valeur fasse partie de la population " contrôle ". Le " sigma " moyen pour les valeurs " contrôles " du Complexe I était de 0.961 et celui pour les valeurs " contrôles " du Complexe IV était de 0.887. Ceci implique que les valeurs " contrôles " du Complexe I et les valeurs " contrôles " du Complexe IV ne sont pas significativement différentes entre elles.

      Le " sigma " moyen des patients " investigués " était de 0.786 (extrêmes : 0.031-0.981) pour le Complexe I et celui pour le Complexe IV était de 0.730 (extrêmes : 0.00-0.993). Ceci implique également que les valeurs des coefficients de contrôle du Complexe I d'une part et du Complexe IV d'autre part pour les patients " investigués " ne sont pas significativement différentes. Les données sont détaillées dans un tableau pour chaque patient plus loin.

      Lorsque l'on compare les valeurs " investigués " aux valeurs " contrôles " du Complexe I, le sigma moyen est de 0.771. Lorsque l'on compare les valeurs " investigués " aux valeurs " contrôles " du Complexe IV, le sigma moyen est de 0.760. Il n'existe donc pas de différence significative entre les valeurs des coefficients de contrôle des deux Complexes lorsqu'on considère les deux populations globalement. La différence apparaît lorsqu'on compare individuellement chaque valeur de coefficient de chaque patient " investigué " avec celles des patients " contrôles ". Cette analyse est détaillée plus loin pour chacun des patients " investigués ".

      Les flux maximaux " contrôles " (nmolO2/min/mgprot) présentent une dispersion statistique importante. Nous avons tenté de voir quelle était la distribution en fonction de l'âge (cf. graphique 1). On peut voir que l'augmentation proportionnelle du flux lié aux substrats Glutamate-Malate-ADP (Flux 1=G-M-ADP) par rapport à celui lié aux substrat Glutamate-Malate-Succinate-ADP (Flux 2=G-M-Succ-ADP) est grossièrement la même pour chaque patient " contrôle ". Nous pouvons également tirer une courbe de tendance pour les Flux 1 et 2 et voir que la consommation d'O2 rapportée au contenu en protéines non collagéniques des fibres musculaires semble augmenter avec l'âge des patients " contrôles ". On s'attendrait à ce que la consommation d'oxygène dans les tissus diminue avec l'âge, allant de pair avec un ralentissement des activités métaboliques. Cependant, il est également possible que le contenu en protéines des fibres musculaires baisse plus rapidement que la fonction mitochondriale avec le vieillissement, expliquant ainsi l'augmentation du rapport consommation O2/contenu en protéines.

      Cependant, ces données ne sont pas utilisables étant donné le faible nombre de valeurs obtenues (n= 17 et 15 pour Complexe I et IV respectivement).

      

Graph. 1 . Distribution Age-flux max "contrôles"


5.2 Biochimie 

      L'analyse statistique des résultats des mesures d'activités biochimiques a été effectuée sous la responsabilité du laboratoire central de chimie du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois. Le test de Mann-Withney (non paramétrique) a été utilisé pour déterminer si les populations étaient significativement différentes ou non avec une valeur définie de p<0.05. La table 7 montre les valeurs de p. Elles ne sont pas significatives (cf. table 7).

      Les valeurs des activités biochimiques étant très dispersées, nous avons choisi d'utiliser la méthode du percentile et de la déviation standard (statistique descriptive). Les 5ème et 95ème percentiles sont donnés pour chaque activité biochimique spécifique et rapportée à la citrate synthase (CS) dans la table 8.

      
Tabl. 7 : [Mann Withney U test]
Mann Withney U test
Type d'activité biochimique Rank S Contrôle Rank S Investigué U Z p-level N (Contrôles) N (Investigués)
Citrate synthase (CS) nmole/min/mg Prot. 847 329 209 -0.8563 0.3918 33 15
Complexe I nmole/min/mg Prot. 735 393 174 -1.3259 0.1849 33 14
Complexe IV nmole/min/mg Prot. 764.5 364 236.5 -0.0798 0.9363 32 15
Complexe I rapporté à la CS 723 405 162 -1.605 0.1085 33 14
Complexe IV rapporté à la CS 741 387 213 -0.6161 0.5378 32 15

      
Tabl. 8 : [Méthode du percentile et de la déviation standard]
Type d'activité biochimique Moyenne N (valeurs contrôles) Médiane Minimum Maximum 5th percentile (-2DS) 10th percentile 90th percentile 95th percentile (+2DS)
Citrate synthase (CS) nmole/min/mg Prot. 196.12 33 191 71.91 448.24 84 128.4 254.91 284.38
Complexe I nmole/min/mg Prot. 16.44 33 15 4 33.94 4 4.52 26.64 32.98
Complexe IV nmole/min/mg Prot. 84.13 32 67.88 23 224.65 23.45 28.1 136.63 212.54
Complexe I rapporté à la CS 8.85 33 8.6 1.59 17.2 2.2 3.13 14.09 15.3
Complexe IV rapporté à la CS 41.73 32 36.15 16.09 76.11 19.5 24.51 64.56 75.64


5.3 Carnitine :

      Le test de normalité (Kolmogorov-Smirnov) pour les valeurs " contrôles " révèle un p à 0.03, donc une différence significative entre les différents contrôles et une population théorique normale (distribution gaussienne). La distribution des valeurs " contrôles " de carnitine est donc non-normale (non-gaussienne).

      Le même test de normalité pour les valeurs de carnitine des patients " investigués " révèle un p de 0.2, donc une différence non significative entre les différents sujets testés.

      Finalement, lorsq u'on essaie de comparer les valeurs " investigués " aux valeurs " contrôles " par le test de Mann-Whitney u-test, on ne met pas en évidence de différence significative entre ces deux populations.

      Ces tests statistiques révèlent en réalité que le nombre de valeurs est trop faible pour amener des conclusions sur les taux de carnitine mesurés et comparés entre une population " contrôle " et une population " investigués ". Nous avons donc choisi d'utiliser la statistique descriptive (percentile et déviation standard) pour comparer les valeurs " contrôle " et " investigués). La moyenne des valeurs " contrôles " pour la carnitine est de 8.2 +/- 3.5 mmol/g prot (DS).


6. Description des patients et résultats


6.1 Description des sujets " contrôles " et résultats

      Nous avons d'abord effectué des biopsies de muscle deltoïde chez 33 sujets " contrôles ", puis, entre mars et septembre 1999, chez 26 sujets présentant des symptômes musculaires compatibles avec un dysfonctionnement du métabolisme mitochondrial désignés sous le terme de " patients investigués ". Le prélèvement a toujours été pratiqué par le même chirurgien qui contrôlait également toutes les autres étapes de l'expérience oxymétrique sans exceptions. Tous les sujets ont signé un consentement éclairé en présence du responsable de l'étude (AAF). Le prélèvement musculaire se faisait en anesthésie générale chez les sujets " contrôles " car l'intervention pour laquelle ils étaient hospitalisés l'exigeait, et elle se faisait en anesthésie locale à la xylocaïne 1% chez les sujets " investigués " comme c'est généralement le cas pour les biopsies musculaires pratiquées chez les adultes.

      Les sujets " contrôles " ont été choisis parmi des patients souffrant d'une pathologie orthopédique de l'épaule qui pouvait être soit une rupture de la coiffe des rotateurs traumatique ou dégénérative, soit une instabilité (luxation récidivante de l'épaule). La pathologie dégénérative concernait en général des patients plus âgés.

      Les sujets " contrôles " devaient répondre à un certain nombre de critères d'inclusion à l'étude avant de subir un prélèvement musculaire: bon état général, pas d'amyotrophie du segment concerné, pas de douleurs musculaires chroniques et diffuses à l'effort ou au repos, bonne santé habituelle (notamment pas de pathologie oncologique, rhumatologique telle que polyarthrite ou autre maladie systémique grave), pas d'antécédent d'intervention chirurgicale sur l'épaule où le prélèvement serait effectué, pas de traitement aux corticoïdes dans les 30 jours précédemment à l'intervention actuelle.


6.1.1 Valeurs contrôles oxygraphie

      Toutes les biopsies de ces sujets ont subi exactement le même processus que celles des patients investigués. Toutes les coupes histologiques de ces biopsies ont été analysées et décrites comme étant dans les limites de la norme par la même personne (G. Pizzolato). Le screening de routine de l'ADNmt n'a pas révélé de mutations chez ces patients.

      Dix-sept sujets " contrôles " sur trente-trois testés (efficacité de 52%) pour le Complexe I et quinze sur vingt-quatre (efficacité de 45%) pour le Complexe IV ont finalement été retenus pour le calcul des valeurs des coefficients de contrôle et seize sur trente-trois (efficacité de 48%) pour celui des consommations maximales d'oxygène. La moyenne d'âge de ces 17 sujets finalement retenus était de 44.2 années (21-64), la médiane était de 48 années. Les sujets qui n'ont pas été inclus présentaient le plus souvent des tracés oxymétriques non interprétables en raison de problèmes rencontrés lors de la préparation ou en raison d'erreurs de manipulation lors de l'expérimentation, notamment lors de la phase initiale (courbe d'apprentissage). Par contre, toutes les valeurs obtenues en biochimie, en génétique mitochondriale et mesure de l'activité de la carnitine ont été retenues, ces examens étant pratiqués de routine.

      Pour ce qui est de la respiration maximale des mitochondries, c'est-à-dire la consommation mitochondriale maximale d'oxygène en conditions de saturation en substrats et produits (stade III de la respiration), normalisée au poids de protéines non collagéniques des fibres musculaires, nous avons obtenu les valeurs moyennes exprimées en (x) +/- (1DS) avec n=16. Elles sont présentées dans la table 9 en fonction des différents substrats utilisés.

      
Tabl. 9 : [Valeurs moyennes en fonction des différents substrats utilisés]
Oxymétrie (HUG) Flux maximaux (n=16) Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP P-Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax moyen (nmolO2/min/mgprot) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8

      Dans ce tableau il faut noter la stricte égalité entre les valeurs obtenues lors d'une même mesure avec les substrats pyruvate-malate et celles obtenues avec glutamate-malate. Il nous paraissait important de le souligner, car cette façon de procéder nous permettait théoriquement de détecter un déficit en pyruvate déhydrogénase (PDH) ce qui ne se manifesterait pas sur les valeurs de coefficient de contrôle des complexes respiratoires mitochondriaux.

      On peut également constater l'importance de la déviation standard qui représente environ 30% des trois valeurs. Nous reviendrons sur l'interprétation de ces valeurs.

      En ce qui concerne les coefficients de contrôle des complexes I et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, nous avons obtenu les valeurs moyennes exprimées en (y) +/- (1DS), pour n=17 et 15 respectivement, répertoriées dans la table 10.

      
Tabl. 10 : [Coefficients de contrôle des complexes I et IV]
Coefficients de Contrôle Ci Complexe I (n =17) Complexe IV (n=15)
Valeurs " contrôle " moyennes 0.26+/-0.04 0.14+/-0.03

      Ici les déviations standard sont beaucoup moins importantes, témoignant de la précision de la méthode et le test de normalité que nous avons effectué (cf. " Analyse Statistique ", test de Shapiro-Wilks) confirme ceci. Le " sigma " moyen déterminé lors du test de Shapiro-Wilks pour les valeurs contrôles du Complexe I était de 0.961 et celui pour le Complexe IV était de 0.887 signifiant qu'il n'existe pas de différence significative entre les valeurs contrôles.


6.1.2 Carnitine libre

      Nous avons également déterminé les valeurs contrôles pour les mesures de carnitine libre dans le muscle deltoïde chez 24 sujets. Les mesures ont été effectuées par l'équipe du Prof. Girardin du Département de Pédiatrie des HUG. La méthode de détermination en laboratoire a été exposée plus haut. Les résultats sont exprimés en (z) +/- (1DS) avec n=24. L'unité de mesure de l'activité de la carnitine est donnée en mmol/g de protéines non collagéniques. La valeur moyenne est exposée dans la table 11.

      
Tabl. 11 : [Valeur moyenne de Carnitine]
  Valeur Contrôle moyenne de Carnitine (n=24)
Carnitine libre (mmol/g prot.) 8,33 +/- 3,6


6.1.3 Activités biochimiques des Complexes I et IV

      Pour ce qui est des activités biochimiques, nous avons pu obtenir 33 valeurs contrôles pour les Complexes respiratoires I et IV. Les autres valeurs pour les Complexes II (partiel et total), le segment II-III, le Complexe III ont été considérées dans l'interprétation des résultats des patients investigués lorsque les résultats de ces derniers étaient disponibles (cf. " Résultats des patients investigués "). Comme on peut le constater, le nombre de patients " contrôles " pour les activités biochimiques constitue plus du double des patients " contrôles " pour l'oxygraphie. En effet, les deux paramètres étaient mesurés par des laboratoires différents, et en ce qui concerne l'oxygraphie, nous avons été extrêmement sévères dans la sélection des tracés pouvant servir au calcul des " coefficients de contrôle ".

      La dispersion des résultats d'activité biochimique étant très importante, l'analyse statistique s'est faite par calcul des percentiles (cf. " Analyse Statistique "). La méthode reste peu précise puisqu'on sait que l'on exclut de la distribution 5% de patients potentiellement " normaux ". Les valeurs pour chaque complexe sont exposées dans les tables 12a et 12b.

      

Tabl. 12a : Activités spécifiques moyennes des Complexes respiratoires et de la Citrate Synthase normalisées en mg de protéines non collagéniques.

      Nous les avons exprimées ici en 5ème et 95ème percentiles.

      

Tabl. 12b : Activités rapportées à la Citrate Synthase des Complexes de la chaîne respiratoire (en%).

      Nous les avons aussi exprimées en 5ème et 95ème percentiles.


6.2 Description des patients " investigués " et Résultats

      Les sujets " investigués " ont été au nombre de 26 avec une moyenne d'âge de 38.2 années (19-80, médiane 34.5 années). Il s'agissait de 14 hommes (moyenne d'âge 38.6, médiane 36) et 12 femmes (moyenne d'âge 39.2, médiane 35). Ils présentaient depuis une période pouvant aller jusqu'à plusieurs années des symptômes musculaires à l'effort ou au repos. Il s'agissait de douleurs inhabituelles à l'effort ou se prolongeant anormalement après l'effort ou même de douleurs déjà au repos. Le point commun de tous ces patients était l'apparition de ces symptômes au cours de leur vie avec pour certains d'entre eux une évolution progressivement défavorable.

      Une fois obtenu le consentement éclairé de tous les sujets, le prélèvement était effectué. En ce qui concerne les sujets " contrôles ", la biopsie musculaire s'effectuait immédiatement après incision cutanée de telle manière à éviter de prélever un muscle traumatisé par les instruments chirurgicaux. Il est important de souligner que le choix du site de biopsie doit se porter sur la partie charnue du muscle, et non pas sur la jonction musculo-tendineuse qui est trop fibreuse (cf. fig. plus haut sur prélèvement).

      Tous ces patients faisaient également l'objet d'un screening d'examens sanguins comprenant une formule sanguine, une vitesse de sédimentation érythrocytaire (VS), une protéine C-réactive (CRP), une chimie (Na+, K+, Mg++, Ca++, P, glycémie, créatinine, lactate sérique, protéines sériques, phosphatase alcaline), un dosage enzymatique (ASAT, ALAT, gamma-GT, créatine kinase) un dosage hormonal (T4 libre et TSH).

      Patient AA29.3.99

      Patient de 25 ans présentant une intolérance à l'effort uniquement avec des myalgies diffuses, mais prédominant aux membres inférieurs, proximalement. Screening sanguin dans les limites de la norme, sauf une discrète augmentation des CK au repos. L'ENMG comportait des signes mineurs évocateurs d'une atteinte myogène. Le patient est inclus dans notre protocole.

      Résultats : cf. p. 81

      Oxymétrie : Les flux maximaux sont dans la norme pour ce patient. Les coefficients de contrôle n'ont pas pu être déterminés en raison de problèmes techniques dans la réalisation des mesures (il s'agissait du premier patient testé).

      Biochimie : Les activités spécifiques et celles rapportées à la citrate synthase (%CS) est dans la norme pour le complexes IV, celle du Complexe I est à la limite supérieure (95ème percentile). Les activités des autres complexes de la chaîne respiratoire n'ont pas pu être déterminés par manque de matériel (biopsie en quantité insuffisante).

      Carnitine : très abaissée.

      Histologie : dans la norme.

      Génétique mitochondriale : pas d'anomalie détectée.

      Discussion : patient que l'on peut considérer comme étant dans la limite de la norme pour l'ensemble des résultats lorsqu'ils sont confrontés aux symptômes cliniques. La carnitine tissulaire très abaissée isolément ne peut pas être interprétée surtout dans un contexte d'histologie normale du muscle (pas d'accumulation de gouttelettes lipidiques). Il s'agit peut-être d'une erreur de mesure ou d'un mauvais conditionnement de la biopsie ce qui pourrait également expliquer l'absence de résultats pour les coefficients de contrôle.

      Patient AV17.5.99

      Patiente de 34 ans, activité sportive intense. Douleurs musculaires à l'effort avec intensification dans les derniers temps avant la biopsie, prédominantes aux membres supérieurs, proximalement. Apparition de douleurs également de type insertionnelles. L'examen clinique neurologique ainsi que l'ENMG effectués par un neurologue en hôpital universitaire se sont avérés être dans la norme. Les CK se sont révélés être augmentés de deux à dix fois la norme. On désire exclure une éventuelle myopathie. Dans le diagnostic différentiel, on évoque également une fibromyalgie.

      Résultats : cf. page 82

      Oxymétrie : Les flux maximaux sont dans les limites de la norme. Le coefficient de contrôle du Complexe IV est dans la norme, celui du Complexe I est abaissé en dessous de 2DS.

      Biochimie :Valeurs dans les limites de la norme.

      Carnitine :Dans les limites de la norme.

      Histologie : Dans les limites de la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : La valeur abaissée de plus de 2DS pour le coefficient de contrôle du Complexe I se vérifie lorsqu'on applique les critères plus restrictifs de l'analyse statistique par le test de Shapiro-Wilk (sigma = 0.310). A la lumière des résultats des autres tests toutefois, on peut conclure que cette anomalie isolée n'est pas suffisante pour établir un trouble du métabolisme de la chaîne respiratoire mitochondriale (OXPHOS) chez cette patiente. En effet, dans notre hypothèse de travail, on suppose que s'il existe une anomalie de contrôle au niveau d'un complexe respiratoire, elle se répercute sur les autres complexes, ce qui ne semble pas être le cas chez cette patiente (cf. tableau 13).

      Patient AM15.3.99

      Patiente de 36 ans, intolérance musculaire et myalgies à l'effort. Elle décrit des épisodes paroxystiques de fatigue intense associés à des faiblesses et des douleurs musculaires diffuses des quatre membres. On notera également des troubles de la thymie sous forme d'asthénie, d'insomnies et d'anxiété notamment. Le screening sanguin est dans la norme et l'ENMG est compatible avec une atteinte myogène. Elle avait déjà fait l'objet de deux biopsies musculaires qui s'étaient révélées normales. Nous l'avons incluse dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 83

      Oxymétrie : Pas de résultats disponibles pour les flux maximaux. Problèmes lors des mesures. La seule valeur de coefficient de contrôle disponible est celle du Complexe IV et qui est dans les limites de la norme.

      Biochimie : Les activités des Complexes I, IV, II total et III sont dans les limites de la norme.

      Carnitine : Non déterminé.

      Histologie : Dans les limites de la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Beaucoup de problèmes techniques pour la détermination des valeurs d'oxymétrie. Toutefois, au vu des informations mêmes partielles obtenues par ces tests, nous considérons que nous n'avons pas détecté d'anomalie du métabolisme OXPHOS chez cette patiente.

      Patient BJ6.8.99

      Patiente de 33 ans, travaillant dans un bureau, non sportive. Elle présente un an auparavant une atteinte partielle du 3ème nerf crânien à droite se manifestant par une diplopie. Nombreuses investigations dont un ENMG, une analyse du LCR et une IRM qui se sont avérés normaux. Dans l'évolution de sa symptomatologie apparaissent des douleurs musculaires diffuses que l'on retrouve à la palpation paravertébrale et des quatre membres sans niveau prédominant. Screening sanguin dans les limites de la norme.

      Résultats : cf. page 84

      Oxymétrie : Les flux maximaux sont dans les limites de la norme ainsi que les coefficients de contrôle des Complexes I et IV.

      Biochimie : Les valeurs disponibles sont celles des Complexes I et IV et se trouvent dans le limites de la norme.

      Carnitine : Dans les limites de la norme.

      Histologie : Dans les limites de la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Nous considérons que nous n'avons pas détecté d'anomalie du métabolisme OXPHOS chez cette patiente.

      Patient BC7.2.00

      Patiente 36 ans, sédentaire, présentant des symptômes musculaires au repos et à l'effort. Les différents examens sont dans la norme. Incluse dans le protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 85

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme.

      Biochimie : Activités déterminées pour tous les Complexes de la chaîne mitochondriale : dans la norme.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Tous les résultats dans la norme. Nous considérons que nous n'avons pas détecté d'anomalie du métabolisme OXPHOS chez cette patiente.

      Patient BM21.6.99

      Patient d'origine indienne, âgé de 33 ans présentant un syndrome dysmorphique congénital complexe avec scoliose, agénésie du muscle pectoral notamment suspect de syndrome de Brody. Apparition quelques mois avant sa biopsie, de contractures musculaires vraies des loges antéro-externes des jambes survenant à l'effort. A la biologie sanguine on décèle une élévation de la lactacidémie et de la pyruvicémie à plusieurs reprises. L'ENMG ne montre pas de signes en faveur d'une atteinte musculaire.

      Devant la symptomatologie douloureuse à l'effort et les anomalies de laboratoire, on décide de soumettre ce patient à une biopsie musculaire dans le cadre de notre étude.

      Résultats : cf. page 86

      Oxymétrie : Pas de valeurs déterminées, difficultés lors des mesures.

      Biochimie : Valeurs disponibles pour les Complexes I et IV dans les limites de la norme.

      Carnitine : Dans les limites de la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Patient pour lequel la paucité des informations obtenues nous empêchent toute conclusion. Beaucoup de problèmes techniques lors des mesures oxygraphiques, les échantillons musculaires étaient très rapidement endommagés dans l'appareil. Existe-t-il des altérations ultrastructurelles des fibres musculaires chez les patients souffrant de dysmorphismes les rendant mécaniquement très fragiles pour ce type d'expériences ? Sont-ils plus sensibles au traitement par la saponine ?

      Patient BP8.3.99

      Jeune patient de 21 ans, sportif, souffrant d'intolérance musculaire à l'effort associée à des douleurs. Les symptômes sont diffus. Le screening sanguin et l'ENMG sont dans la norme, hormis une CK élevée à une fois et demie la norme. Le patient est inclus dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 87

      Oxymétrie : Pas de valeurs déterminées, beaucoup de problèmes lors des mesures.

      Biochimie : Valeurs disponibles seulement pour les Complexes I et IV avec une activité spécifique au-dessus du 95ème percentile pour le Complexe IV.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : A nouveau un patient pour lequel nous n'avons pu obtenir toutes les informations possibles par ces tests en raison de manque de matériel et endommagement mécanique des fibres lors des mesures oxymétriques. Nous ne pouvons donc rien conclure sur le métabolisme OXPHOS de ce patient.

      Patient CA26.7.99

      Patient de 58 ans, travailleur de force, marathonien présentant une baisse de performance à l'effort un an auparavant. Les symptômes consistent en une faiblesse et raideur musculaire pendant l'effort avec phénomène de " second souffle ". L'examen clinique effectué par un neurologue en milieu universitaire révèle une hypomyotrophie proximale des membres supérieurs avec une minime parésie correspondante. Le patient localise ses symptômes sur les membres supérieurs et inférieurs. Le screening sanguin et l'ENMG sont dans la norme. Devant ce tableau clinique on propose de l'inclure dans le protocole de notre étude.

      Résultats : cf. page 88

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Coefficients de contrôle des Complexes I dans la norme, celui du complexe IV nettement au-dessus de 2DS.

      Biochimie : Valeurs dans la norme pour les Complexes I et IV.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : La valeur du coefficient de contrôle du Complexe IV au-dessus de la norme après analyse selon Shapiro-Wilks (sigma = 0.008). Ce coefficient est donc anormalement élevé. Ceci se corrèle à la symptomatologie du patient et nous permet donc de suspecter qu'il souffre d'une anomalie du métabolisme OXPHOS localisé au Complexe IV. Nous ne pouvons pas aller plus loin dans l'interprétation puisque aucune autre information ne vient appuyer ce résultat.

      Patient DA23.8.99

      Patiente âgée de 35 ans, ménagère, souffrant depuis de nombreuses années de myalgies à l'effort. Une première biopsie musculaire avait été effectuée deux ans auparavant ne mettant pas en évidence d'anomalie spécifique. Douleurs à l'effort prédominant sur les jambes à tel point que la patiente avait même dû subir une fasciotomie bilatérale. Persistance des myalgies à l'effort avec tuméfaction concomitante. Un traitement par CoQ10, Nicotinamide, Mg++ et Carnitine a permis de stabiliser la symptomatologie.

      La patiente nous est adressée pour biopsie dans le cadre de notre protocole.

      Résultats : cf. page 89

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Le coefficient du Complexe I est en dessous de 2DS de la moyenne, celui du Complexe IV est dans la norme.

      Biochimie : L'activité spécifique et rapportée à la CS du Complexe I est au-dessus de 2DS de la moyenne. L'activité du Complexe IV est dans la norme, celle des autres Complexes ne sont pas disponibles.

      Carnitine : Dans la norme

      Histologie : Accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Le sigma du coefficient de contrôle du Complexe I est à 0.924. Celui du Complexe IV est à 0.731. On considère qu'ils sont donc proches de la norme d'après l'analyse statistique selon Shapiro-Wilk.

      Patient FM7.9.99

      Patiente âgée de 33 ans, ménagère, non sportive et qui souffre de myalgies diffuses des quatre membres à l'effort depuis dix ans. Elle a un fils âgé de dix ans souffrant de la même symptomatologie. Les examens biologiques et électrophysiologiques sont tous dans la norme. La patiente est proposée pour notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 90

      Oxymétrie : Flux maximaux et coefficients de contrôle dans la norme.

      Biochimie : Pas de résultats disponibles, manque de matériel.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries et augmentation du nombre de fibres de type I.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Pas de conclusion définitive possible sur les informations disponibles. Toutefois les coefficients de contrôle nettement dans la moyenne laissent peu de place à la probabilité d'une anomalie du métabolisme OXPHOS.

      Patient GY21.7.99

      Patient âgé de 50 ans, travailleur de force souffrant depuis l'adolescence de myalgies diffuses à l'effort. La symptomatologie est en réalité nettement plus marquée juste après l'effort. Un traitement par magnésium semble améliorer quelque peu le syndrome clinique. Le repos est bénéfique. L'administration de carnitine n'a pas eu d'effet. Ce patient a subi des investigations biologiques et électrophysiologiques qui se sont révélées normales.

      Résultats : cf. page 91

      Oxymétrie : Les flux maximaux sont dans la norme. Le coefficient du Complexe IV est dans la norme, celui du Complexe I n'est pas disponible.

      Biochimie : Activités dans la norme.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Sur la base des valeurs disponibles, pas d'anomalie OXPHOS détectée. Mais les informations sont incomplètes.

      Patient HV29.4.99

      Patient hispanique âgé de 36 ans, sédentaire, souffrant de myalgies prédominant proximalement aux membres inférieurs depuis de nombreuses années. Les investigations sous forme notamment de biologie sanguine et d'ENMG n'ont pas permis de mettre en évidence d'anomalie musculaire. Une biopsie effectuée à l'aiguille deux ans auparavant révélait la présence d'une augmentation en taille et en nombre des gouttelettes lipidiques intramusculaires avec également une prédominance de fibres de type I. On suspectait donc une myopathie lipidique sans avoir pu le confirmer ultérieurement.

      A noter également la découverte fortuite dans le cadre d'un état grippal d'une cardiomyopathie dilatative d'origine indéterminée sans signes de décompensation. Le patient est inclus dans le protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 92

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Les coefficients de contrôle des Complexes I et IV sont tous les deux en dessous de 2DS.

      Biochimie : Activités spécifiques et rapportées à la CS disponibles pour tous les Complexes, sauf le segment II-III. Les valeurs sont dans la norme, celle du Complexe III étant à la limite inférieure du 5ème percentile.

      Carnitine : L'activité de la carnitine tissulaire (muscle) est nettement abaissée.

      Histologie : Augmentation du nombre et de la taille des gouttelettes lipidiques dans le muscle.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : La symptomatologie du patient, l'abaissement important de la carnitine tissulaire, le résultat histologique, tous concordent pour poser le diagnostic de déficit primaire en carnitine. Après analyse selon Shapiro-Wilk, le sigma du coefficient de contrôle du Complexe I est de 0.055 et celui du Complexe IV est de 0.378. Ils sont donc en dehors de la norme. Il y a donc une diminution du contrôle métabolique par ces deux complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale et qui pourrait être une modulation visant à compenser le bloc au niveau de la b-oxydation.

      Patient JC22.7.99

      Patiente âgée de 33 ans, sédentaire, souffrant notamment de polypose intestinale présentant également un hémangiome unique hépatique. Elle se plaint de myalgies et de tremblements dans tous les membres au repos, mais aussi à l'effort avec impossibilité de monter plus d'un étage à pied. Cliniquement une ptose palpébrale associée à une ophtalmoplégie des muscles droits supérieurs des yeux. Ce syndrome semble être congénital et héréditaire puisque présent chez plusieurs autres membres de la famille. Dans un premier lieu on suspecte le diagnostic de fibrose congénitale des muscles externes de l'oeil et en deuxième hypothèse une ophtalmoplégie externe progressive, maladie d'origine mitochondriale. Au niveau des examens de laboratoire on ne note pas d'anomalies de valeur du pyruvate, du lactate ou des CK musculaires. La patiente est incluse dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 93

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Le coefficient de contrôle du Complexe I est bien en dessous de 2DS de la norme, celui du Complexe IV est dans la norme.

      Biochimie : Pas de valeurs disponibles, pas assez de matériel.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Peu de résultats disponibles. Après analyse selon Shapiro-Wilk, le sigma du Complexe I est de 0.101. Sur la base de l'histologie et de ce coefficient très abaissé qui peut signifier une redistribution du contrôle métabolique, on est en droit de suspecter une anomalie du métabolisme OXPHOS localisé dans le segment des Complexes II et III. Des anomalies localisés à ce segment ont été décrites dans l'ophtalmoplégie externe progressive (CPEO), syndrome qui pourrait correspondre à la présentation clinique de cette patiente [1].

      Patient MB31.8.99

      Patient âgé de 19 ans, sportif amateur. Une biopsie à l'aiguille précédente (1998) avait montré une accumulation mitochondriale avec prédominance de fibres de type I. Les autres examens se sont révélés dans la norme.

      Résultats : cf. page 94

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Le coefficient de contrôle du Complexe I est nettement en dessus de la norme (>2DS). Celui du Complexe IV est dans la norme.

      Biochimie : Les activités des Complexes I et IV sont dans la norme. Les valeurs des autres Complexes ne sont pas disponibles.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Après analyse selon Shapiro-Wilk, le sigma du Complexe I est à 0.031 donc nettement en dehors de la norme. Ce coefficient très élevé corrélé à des activités spécifique et %CS à la limite inférieure de la norme ainsi que l'histologie du muscle vont tous dans le sens d'une anomalie OXPHOS localisée au Complexe I. Nous n'avons pas d'autre test appuyant cette conclusion.

      Patient MS7.6.99

      Patiente âgée de 21 ans présentant une intolérance musculaire diffuse à l'effort. Les différentes investigations biologiques et électrophysiologiques se sont révélées normales. Incluse dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 95

      Oxymétrie : Les flux maximaux sont dans les limites de la norme tout comme les coefficients de contrôle.

      Biochimie : Disponibles pour les Complexes I et IV, dans la norme.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Patiente chez qui l'on ne détecte pas d'anomalie du métabolisme OXPHOS par ces méthodes.

      Patient MN21.9.99

      Patiente sportive amatrice âgée de 32 ans présentant depuis cinq ans des douleurs musculaires à l'effort au niveau des cuisses et des mollets accompagnées de faiblesses. L'examen clinique effectué par un neurologue est parfaitement normal. La biologie montre une élévation des CK musculaires et des LDH avec également une atteinte caractérisée de myogène à l'ENMG. La patiente est incluse dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 96

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Coefficients de contrôle des Complexes I et IV dans la norme.

      Biochimie : Les activités de complexes n'ont pas été déterminées faute de matériel.

      Carnitine : Non déterminé, faute de matériel.

      Histologie : Accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries et augmentation du nombre de fibres de type I.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Sur la base des coefficients de contrôle et en se référant au théorème de la somme, pas d'anomalie du métabolisme OXPHOS. Ce qui n'exclut en rien une autre localisation.

      Patient MF8.5.00

      Patient infirmier de profession, âgé de 55 ans connu pour un rhumatisme articulaire aigu traité dans l'enfance. Il se plaignait depuis de nombreuses années de fatigabilité musculaire diffuse des membres. Un ancien ENMG suspectait fortement la présence d'une myopathie. Une biopsie à l'aiguille faite à la suite montrait une accumulation de gouttelettes lipidiques. Le patient est inclus dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 97

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Coefficient de contrôle du Complexe I dans la norme, celui du Complexe IV nettement abaissé en dessous de 2DS de la moyenne.

      Biochimie : Les activités spécifiques et en %CS sont disponibles pour tous les Complexes OXPHOS, tous dans la norme.

      Carnitine : Dans la norme

      Histologie : Maladie de Mc Ardle (coloration spécifique pour la myophosphorylase).

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Après analyse selon Shapiro-Wilk, le sigma du Coefficient de contrôle du Complexe IV est de 0.993. La valeur n'est donc pas en dehors de la norme selon ce test statistique de normalité. Les coefficients de contrôle sont donc tous les deux dans la norme.

      C'est après un complément d'anamnèse que le patient décrit un phénomène de " second souffle " et l'on évoque alors la maladie de Mc Ardle. Ce qui est confirmé par une coloration histologique complémentaire spécifique pour la myophosphorylase.

      Patient MN 15.9.99

      Patient d'origine indienne âgé de 61 ans, sédentaire, souffrant de myalgies diffuses des quatre membres après l'effort. Il est tout à fait capable de maintenir un travail musculaire soutenu et prolongé du type course, mais ressent des douleurs quelques heures après le repos et qui perdurent plusieurs jours. La biologie sanguine montre une élévation importante des lactates et pyruvates après l'effort. Elévation chronique des aldolases, des CPK et de la myoglobine sans changement avec l'effort. Enfin on détecte également la présence d'anticorps antithyroglobuline.

      Du point de vue électrophysiologique, pas d'éléments en faveur d'une atteinte myogène. Le patient est inclus dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 98

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Coefficient du Complexe I augmenté au dessus de 2DS de la moyenne, celui du Complexe IV est dans la norme.

      Biochimie : Valeurs déterminées pour tous les Complexes, sauf le CII total et le CIII. Les activités spécifiques et %CS du segment CII-III sont abaissées en dessous du 5ème percentile.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : D'après l'analyse selon Shapiro-Wilk, la valeur du coefficient de contrôle du Complexe I peut en fait être considéré comme étant dans la norme (sigma = 0.822). Dans ce contexte, les valeurs abaissées du segment CII-III à la biochimie ne sont pas interprétables, puisque les coefficients des complexes I et IV sont dans la norme. Sur la base de ces résultats, nous ne pouvons pas conclure à une anomalie du métabolisme OXPHOS chez ce patient.

      Patient PC28.6.99

      Patiente sédentaire, âgée de 38 ans aux lourds antécédents médicaux (encéphalopathie cérébelleuse, épilepsie type Grand Mal) et dont le syndrome clinique est essentiellement dominé par une ataxie cérébelleuse provoquant de nombreuses chutes. Dans les examens déjà entrepris, on note une biologie sanguine au repos avec des lactates, des CK et pyruvates dans la norme, une ancienne biopsie musculaire (quadriceps) effectuée à Paris sept ans auparavant sur laquelle on avait observé des " ragged red fibers ", une histologie plus récente à Genève sur laquelle on ne retrouvait pas ce type de fibres mais quelques fibres musculaires Cox négatives, une analyse enzymatique mitochondriale effectuée au CHUV à Lausanne montrant une activité limite inférieure pour le complexe I sans augmentation de l'activité de la CS, finalement une analyse génétique mitochondriale de dépistage effectuée à Genève ne révélant pas de mutation (recherche de MELAS, MERRF et NARP/Leigh). Suspicion d'encéphalopathie d'origine mitochondriale raison pour laquelle la patiente est incluse dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 99

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Le coefficient de contrôle du Complexe I est juste en dessous de 2DS de la moyenne, celui du Complexe IV est nettement en dessus de 2DS.

      Biochimie : Les activités ne sont disponibles que pour les Complexes I et IV. L'activité spécifique du Complexe I est discrètement au dessus du 5ème percentile, celle rapportée à la CS est dans la norme. De même, l'activité spécifique du Complexe IV est au-dessus de la norme, celle rapportée à la CS est dans la norme.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries, augmentation du nombre de fibres de type I.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Le coefficient de contrôle du Complexe I est dans la norme après analyse selon Shapiro-Wilk (sigma = 0.924). Celui du Complexe IV est anormalement élevé (sigma = 0.016). Confronté aux informations histologiques obtenues par les différentes biopsies, on peut en conclure que cette patiente présente très probablement un déficit du métabolisme OXPHOS spécifiquement localisé au Complexe IV. Cependant, aucun autre examen biochimique ne vient infirmer ou confirmer cette conclusion.

      Patient PP24.8.99

      Patiente âgée de 80 ans chez qui on diagnostique une polymyosite médicamenteuse en 1982, traitée par corticoïdes et immunosuppresseurs évoluant favorablement pendant dix ans. Récidive en 1993 avec faiblesse musculaire. Le bilan sanguin large ne révélait aucune anomalie inflammatoire. Une première biopsie musculaire à l'aiguille est effectuée quatre ans avant celle-ci et révèle une prédominance aspécifique de fibres du type I. Cliniquement, au moment où nous la voyons, elle présente essentiellement des faiblesses proximales, même au repos, des quatre membres sans prédominance pour un segment particulier. Nous l'avons incluse dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 100

      Oxymétrie : Les flux maximaux sont dans la norme. Le coefficient de contrôle du Complexe I est au dessus de 2DS de la moyenne, celui du Complexe IV est dans la norme.

      Biochimie : Les valeurs disponibles sont celles des Complexes I et IV, tous dans la norme.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Myopathie inflammatoire granulomateuse, compatible avec une sarcoïdose.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Le diagnostic histologique est corrélé à la symptomatologie. Après analyse selon Shapiro-Wilk, le sigma du coefficient de contrôle du Complexe I est de 0.793, c'est-à-dire dans la norme. L'histologie permet de poser le diagnostic final de sarcoïdose.

      Patient PE6.3.00

      Patient âgé de 42 ans, très sportif, souffrant de douleurs proximales des membres inférieurs, à l'effort et cédant au repos après quelques minutes. Les différents examens biologiques et neuromyographiques effectués se sont révélés normaux, hormis une CK nettement augmentée au repos. Le patient a été inclus dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 101

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Les coefficients de contrôle de Complexes I et IV sont dans la norme.

      Biochimie : Les activités biochimiques sont disponibles pour tous les Complexes et sont dans la norme, sauf les activités spécifiques et %CS du CII total qui sont au dessus du 95ème percentile.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Discrète accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Les résultats oxymétriques sont dans la norme. Les résultats biochimiques, dans ce contexte, sont également considérés comme étant dans la norme. Nous n'avons donc pas pu détecter d'anomalie du métabolisme OXPHOS chez ce patient.

      Patient RF3.9.99

      Patient apprenti boulanger âgé de 25 ans souffrant de myalgies depuis de nombreuses années. Les symptômes sont localisés en prédominance aux membres inférieurs, mais touchent également les membres supérieurs, au repos et lors d'activités physiques. Patient connu pour une maladie de Basedow traitée. Le bilan sanguin montre une augmentation des CK à une fois et demie la norme. Le bilan thyroïdien est dans la norme sans traitement. L'ENMG est dans la norme également. Le patient est inclus dans notre protocole.

      Résultats : cf. page 102

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Coefficients de contrôle dans la norme.

      Biochimie : La biochimie n'est disponible que pour le Complexe IV, dans la norme.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Peu d'informations biochimiques chez ce patient, mais sur la base des coefficients de contrôle, nous n'avons pas détectée d'anomalie du métabolisme OXPHOS.

      Patient RD23.9.99

      Patient âgé de 25 ans, sportif amateur ayant présenté d'importantes myalgies et une asthénie sans effort un an avant sa biopsie. Les CPK étaient très élevés à ce moment et ce sont normalisées par la suite. Quelques mois avant sa biopsie, même symptomatologie avec à nouveau des PK très élevés. Autre examens (ENMG, etc.) dans la norme. On l'inclut dans notre protocole.

      Résultats : cf. page 103

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Coefficients de contrôle dans la norme.

      Biochimie : Non déterminée par manque de matériel.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Sur la base des coefficients de contrôle, pas d'anomalie du métabolisme OXPHOS détectée.

      Patient RS15.5.00

      Jeune patient sportif amateur âgé de 21 ans et souffrant de douleurs musculaires à l'effort de façon prédominante aux membres inférieurs. Les différentes investigations habituelles n'ont pas permis de détecter d'anomalie. Il est inclus dans notre protocole d'étude.

      Résultats : cf. page 104

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Coefficients de contrôle dans la norme.

      Biochimie : Pas de valeurs disponibles, manque de matériel.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Pas de valeurs biochimiques, mais sur la base des autres examens notamment les coefficients de contrôle, nous n'avons pas pu détecter d'anomalie du métabolisme OXPHOS chez ce patient.

      Patient RM1.9.99

      Patient cheminot de profession, âgé de 56 ans qui a commencé à se plaindre de lâchages de son membre inférieur droit. Les investigations électrophysiologiques à la recherche d'une pathologie radiculaire sont restées négatives. Par contre, elles mentionnaient quelques anomalies en faveur d'une atteinte musculaire raison pour laquelle le patient a été inclus dans notre protocole. A noter encore que les valeurs de laboratoire sanguin étaient dans la norme.

      Résultats : cf. page 105

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme, mais à la limite supérieure. Le coefficient de contrôle du Complexe I est dans la norme. Le coefficient de contrôle du Complexe IV est nettement au dessus de 2DS de la moyenne.

      Biochimie : L'activité spécifique de la CS est au dessus du 95ème percentile. Les activités spécifiques et %CS du Complexe I sont au dessus du 95ème percentile. Les activités du Complexe IV sont dans la norme. Les activités des autres Complexes ne sont pas disponibles.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Dans la norme.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Coefficient de contrôle nettement augmenté avec un sigma = 0.000 pour le Complexe IV. Les activités biochimiques du Complexe I sont augmentées, mais il est difficile de les interpréter définitivement. Les flux maximaux malgré leur interprétation également difficile, sont à la limite supérieure de la norme. Donc, sur la base d'une augmentation nette du coefficient de contrôle, on peut raisonnablement suspecter une anomalie du métabolisme OXPHOS localisée au Complexe IV.

      Patient WP15.11.99

      Patiente âgée de 55 ans connue pour une sarcoïdose pulmonaire diagnostiquée en 1973 et qui présente depuis 10 ans une faiblesse musculaire à prédominance proximale au niveau des membres inférieurs. Elle aurait eu à l'époque une biopsie musculaire sur la base de laquelle on aurait diagnostiqué une myopathie mitochondriale, mais aucun rapport écrit n'était disponible au moment de notre étude. Un traitement par corticoïdes a été instauré sans nette amélioration. Les investigations sont poursuivies par une IRM des cuisses qui ne montrera pas d'aspect compatible avec une sarcoïdose musculaire. Entrent dans le diagnostic différentiel soit une myopathie mitochondriale, soit cortisonique, raison pour laquelle elle est incluse dans notre protocole. Le reste des examens sanguins est par ailleurs dans la norme et l'ENMG montre des signes caractéristiques pour une atteinte myopathique.

      Résultats : cf. page 106

      Oxymétrie : Flux maximaux dans la norme. Coefficients de contrôle des Complexes I et IV dans la moyenne.

      Biochimie : Valeurs disponibles pour tous les Complexes. Celles des Complexes IV, II partiel et II total sont au dessus du 95ème percentile.

      Carnitine : Dans la norme.

      Histologie : Augmentation du nombre de gouttelettes lipidiques, accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries, augmentation du nombre de fibres de type I et quelques fibres Cox négatives. Compatible avec une myopathie cortisonique.

      Génétique mitochondriale : Pas d'anomalie détectée.

      Discussion : Nous n'avons pas pu détecter d'anomalie du métabolisme OXPHOS sur la base des coefficients de contrôle des Complexes I et IV qui sont dans la norme. Les valeurs augmentées des activités biochimiques des Complexes IV, II total et partiel restent ininterprétables. L'histologie est compatible avec une myopathie cortisonique.

      Patient AA29.3.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd 13.9 29.5
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   nd nd
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   nd Nd
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 100.3 15.4 65.8   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 15.3 65.6   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 0.94 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient AV17.5.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd 17.6 29.9
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.11 0.19
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,310 0,894
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 178.3 12.1 61.5   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 6.8 34.5   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 5.64 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient AM15.3.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd nd nd
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   nd 0.15
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   nd 0,941
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 169.7 14.3 111.4   nd 39.6 nd 44.1
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 8.4 65.6   nd 23.3 nd 26
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : non déterminé.

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient BJ6.8.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 11 12 18.1
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.25 0.14
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,967 0,941
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 158.2 28.5 68.3   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 18 43.2   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 4.99 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient BC7.2.00

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 10.9 11.5 20.5
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.19 0.16
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,924 0,839
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 183 17 41   32 45 17 75
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 9.1 22.5   17.3 24.7 9.1 40.7
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 10.3 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient BM21.6.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd nd nd
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   nd nd
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   nd Nd
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 171.4 8.2 44.5   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 4.8 25.9   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 9.91 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient BP8.3.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd nd nd
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   nd nd
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   nd Nd
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 222.1 18.2 138.7   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 8.2 62.4   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 6.5 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient CA26.7.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd 13.1 18.7
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.3 0.29
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,957 0,008
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 204 23.7 76.6   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 11.6 37.5   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 5.92 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient DA23.8.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 9.1 10.5 15.9
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.17 0.09
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,924 0,731
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 170 52.1 47.7   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 30.6 28.1   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 5.64 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      Patient FM7.9.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd 14.5 17.1
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.2 0.11
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,941 0,811
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) nd nd nd   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / nd nd   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 4.68 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries et augmentation du nombre de fibres de type I.

      Patient GY21.7.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd 14 22.2
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   nd 0.1
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   nd 0,761
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 137 12.7 68.8   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 9.9 50.2   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 6.85 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient HV29.4.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd 17.1 27.9
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.08 0.03
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,055 0,378
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 166.5 10.4 65.3   20.6 32.7 nd 18.2
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 6.3 39.2   12.4 19.7 nd 10.9
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 0.16 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : augmentation de la taille et du nombre de gouttelettes lipidiques.

      Patient JC22.7.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 9.05 9 14.1
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.09 0.09
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,101 0,731
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) nd nd nd   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / nd nd   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 8.47 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      Patient MB31.8.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 8.4 8.6 11.9
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.44 0.19
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,031 0,894
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 176.1 6.9 67   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 3.9 38.1   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 6.62 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : discrète accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      Patient MS7.6.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd 15 25.6
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.18 0.19
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,817 0,894
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 152.5 21.1 77.1   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 13.8 50.6   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 8.85 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient MN21.9.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 16 17.2 25.6
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.21 0.11
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,978 0,811
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) nd nd nd   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / nd nd   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : non déterminé.

      Histologie : accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries et augmentation du nombre de fibres de type I.

      Patient MF8.5.00

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 8.2 8.7 12.9
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.24 0.07
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,981 0,993
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 112 10 59   24 34 16 40
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 8.8 52.6   21.5 30.5 14.7 36
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 9.83 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : maladie de McArdle.

      Patient MN 15.9.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 16.3 14.9 19.5
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.34 0.18
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,822 0,966
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 146.6 22 69.2   21.1 nd 3.6 nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 15 47.2   14.4 nd 2.5 nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 7.47 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient PC28.6.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd 12.5 17.4
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.17 0.28
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,924 0,016
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 234.7 30.6 140.3   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 13 59.8   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 9.09 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : discrète accumulation sous-sarcolemmales de mitochondries et augmentation du nombre de fibres de type I.

      Patient PP24.8.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 12.9 13 18.9
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.37 0.19
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,793 0,894
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 242 23.9 109.7   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 9.9 45.4   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 7.2 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : sarcoïdose.

      Patient PE6.3.00

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 10.4 11.6 18.2
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.19 0.14
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,924 0,941
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 227 19 45   47 72 30 69
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 8.6 19.9   20.8 31.6 13.1 30.5
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 9.85 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : discrète accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      Patient RF3.9.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 10 10.9 13.8
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.25 0.1
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,967 0,761
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 151.8 nd 56.8   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / nd 37.4   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 5.79 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient RD23.9.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) nd 9.9 16.3
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.24 0.18
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,981 0,966
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) nd nd nd   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / nd nd   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 14.4 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient RS15.5.00

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 16.3 16.4 23.2
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.2 0.12
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,941 0,802
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) nd nd nd   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / nd nd   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 9.48 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient RM1.9.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 17.6 17.9 27.9
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.3 0.6
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,957 0,000
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 300.8 54.7 90.9   nd nd nd nd
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 18.2 30.2   nd nd nd nd
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 9.53 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : dans les limites de la norme.

      Patient WP15.11.99

      nd = non déterminé

      
Oxymétrie (HUG)
Flux maximaux
Pyruvate-malate-ADP Glutamate-malate-ADP Glut.-mal.-ADP-succinate
Jmax (nmolO2/min/mgprot) 17.4 18.5 26.3
Contrôle (n=16) 13.3+/-4.1 13.3+/-4.1 19.3+/-5.8
       
    Complex I Complex IV
Control Coefficients   0.19 0.11
Contrôle (n=17 et n=15)   0.26+/-0.04 0.14+/-0.03
Sigma (Shapiro-Wilk)   0,924 0,811
 
Activités enzymatiques (LCC, CHUV, Lausanne) CS CI CIV   CII partiel CII total CII+CIII CIII
                 
Activités spécifiques (nmoles/min/mgProt) 136 8 96   31 45 18 72
5th percentile 84 4 23.4   14 11 7 18
95th percentile 254 26 114   48 51 37 99
                 
%CS / 6.2 70.6   22.6 33.2 13.4 53.1
5th percentile / 2.2 19.5   5 6 3 10
95th percentile / 15.3 67.6   20 22 28 53

      Carnitine : 6.43 mmol/g prot. (N= 8.33 +/- 3.6)

      Histologie : augmentation nombre gouttelettes lipidiques, accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries, augmentation des fibres de type I, quelques fibres Cytochrome c oxydase (Cox) négatives : compatible avec une myopathie aux corticoïdes. 7. Discussion


7.1 Interprétation détaillée des résultats


7.1.1 A propos des Patients " contrôles " et Valeurs " contrôles "


7.1.1.1 A propos des " patients contrôles "

      Nous avons effectué 33 biopsies deltoïdes dans une population désignée comme " contrôle ". Un certain nombre (16/33=45%) de sujets " normaux " ont finalement été exclus de la population " contrôle " en raison d'erreurs de manipulation identifiées lors des expériences oxygraphiques (fibres mal introduites dans la chambre d'expérimentation, mélangeurs mal synchronisés, etc.). En d'autres occasions nous avons été confrontés à des situations où aucune erreur de manipulation ne pouvait clairement être mise en évidence, mais les tracés enregistrés étaient ininterprétables.

      Nous ne pouvons qu'émettre quelques hypothèses pour expliquer ces anomalies expérimentales. En effet, rien n'exclut que ces sujets supposés " normaux " n'aient été des patients avec une mitochondriopathie non encore avérée. Notons que les analyses génétiques mitochondriales sont revenues normales pour toutes ces personnes. Nous ne pouvons pas non plus écarter l'hypothèse de l'existence de paramètres biologiques intrinsèques ou extrinsèques encore inconnus pouvant modifier le comportement métabolique mitochondrial.

      Les biopsies musculaires du deltoïde ont été effectuées lors d'une anesthésie générale chez le groupe " contrôle ", lors d'une anesthésie locale chez le groupe " investigués ". Les drogues anesthésiques ont-elles un effet direct sur le métabolisme OXPHOS ? Les produits halogénés ont des propriétés inotropes négatives reconnues sur le muscle cardiaque par un mécanisme encore mal connu, mais qui impliqueraient le couplage entre la libération de calcium et la contraction myocardique [39]. Le propofol a systématiquement été utilisé pour l'induction anesthésique des patients " contrôles ". Des expériences sur le myocarde de hamster n'ont pas démontré d'effet cardiodépresseur, même en cas de cardiomyopathie [40]. Pour ce qui est du métabolisme OXPHOS, aucun effet n'est reconnu pour ces produits. L'anesthésie locale sur les patients " investigués " était faite par infiltration à la lidocaïne 1% des tissus sous-cutanés uniquement. Sur la base de ces informations, nous pouvons donc conclure que les deux groupes de patients pouvaient être comparés.

      L'utilisation d'un appareil constitué de chambres pouvant être isolées de l'extérieur afin de créer un " univers " homéostatique avait pour but de minimiser l'effet des éventuels autres paramètres biologiques perturbateurs. Pour les besoins de l'étude nous avons dû ne considérer que les sujets " contrôles " présentant des tracés oxygraphiques répondant à des critères de stabilité (tracé linéaire), de reproductibilité (vérifié en comparant les tracés des deux chambres expérimentales pour un même sujet lors d'une ou de plusieurs mesures). A partir de là, nous avons pu choisir les 17 sujets qui ont servi à constituer la base de données des valeurs oxygraphiques " contrôles " qui a été présentée plus haut. L'analyse statistique a également été discutée plus haut.


7.1.1.2 A propos de l'histologie

      L'analyse histologique, en particulier la détermination d'une accumulation mitochondriale, reste un examen souvent difficile à interpréter, la limite entre une population normale de mitochondries et une accumulation restant floue. C'est pourquoi ce type d'analyse ne permet de diagnostiquer que des dysfonctionnements mitochondriaux sévères. Il doit impérativement être confronté aux autres examens de routine.


7.1.1.3 A propos des activités biochimiques des Complexes respiratoires

      On peut constater que les écarts types des activités biochimiques spécifiques sont très grands. Nous pouvons donc supposer qu'il existe probablement des facteurs encore inconnus qui rendent inhomogène la distribution des valeurs des sujets " normaux ". Selon la théorie de l'Analyse du Contrôle Métabolique, plus le " coefficient de contrôle " d'un Complexe est élevé, plus ce Complexe sera " limitant " ce qui se traduira par un ralentissement de son propre flux métabolique. Partant de là, on peut considérer qu'à partir d'un certain seuil le dysfonctionnement se manifestera par une diminution de l'activité biochimique spécifique du Complexe respiratoire. Nous jugeons donc que des activités biochimiques normales ou élevées, voire très élevées des Complexes de la chaîne respiratoire ne nous apportent aucune information réellement utile. Par contre, si un Complexe possède une activité biochimique proche de zéro alors que celle des autres est normale ou élevée, on est en droit de suspecter une anomalie fonctionnelle de ce Complexe. Cette information doit être confrontée aux autres examens de routine et à l'oxygraphie.


7.1.1.4 A propos de la Carnitine libre

      Comme pour les activités biochimiques des Complexes respiratoires, il existe probablement des facteurs perturbateurs non identifiés. De ce fait, nous avons considéré que les résultats les plus significatifs de carnitine chez les patients " investigués " étaient ceux qui montraient une concentration libre proche de zéro. A nouveau, ces constatations doivent être confrontées aux résultats des autres examens et en particulier à l'histologie musculaire pouvant révéler une accumulation de gouttelettes lipidiques comme cela a été le cas pour le patient HV26499 (cf. " A propos des patients investigués et leurs résultats")


7.1.1.5 A propos des flux respiratoires exprimés en mg de protéines non-collagéniques

      Une certaine proportion des fibres perméabilisées utilisées dans les expériences oxymétriques éclate et le contenu intracellulaire se répand dans le milieu d'incubation. Nous avons des raisons de penser toutefois que les mitochondries qui se retrouvent libérées dans ce milieu restent fonctionnelles et ne subissent pas de traumatisme osmotique ni chimique. En effet, malgré cette dissolution des fibres musculaires dans le milieu expérimental, les tracés oxygraphiques persistaient, démontrant que les mitochondries continuaient à consommer de l'oxygène.

      Théoriquement, on peut donc considérer que la normalisation des valeurs de consommation d'oxygène à la somme totale de protéines mesurées dans le milieu d'incubation et dans les fibres intactes récupérées en fin d'expérience est une méthode reproductible. L'information qu'elle nous apporte ne s'est pourtant pas révélée utilisable.

      Quelle information nous apporte la détermination des flux maximaux ? Les fibres musculaires utilisées peuvent être atrophiées, c'est-à-dire présenter une diminution de leur masse protéique. Chez des patients " normaux ", on ne connaît pas exactement le comportement des mitochondries lorsque le muscle s'atrophie : on peut supposer que in vivo lorsque la charge mécanique du muscle diminue et que sa masse protéique par conséquent baisse également, les mitochondries diminueront aussi leur activité métabolique et se mettront éventuellement en dormance. Ceci constitue une partie de l'hypothèse émise sur les mitochondries sous-sarcolemmales dont le rôle n'est toujours pas élucidé. Dans l'expérience oxymétrique, les mitochondries sont testées in vitro au moyen de substances agissant directement sur leur métabolisme et non pas par l'intermédiaire de la contraction musculaire. Une anomalie au sein du métabolisme même de la mitochondrie pourra théoriquement être détecté, c'est le sujet de cette thèse. Cependant, quelles mitochondries testons-nous exactement ? Quelle est la participation in vitro des mitochondries sous-sarcolemmales qui in vivo ne semblent pas contribuer au métabolisme respiratoire musculaire ?

      Ainsi, que représente une valeur de consommation d'oxygène exprimée en pmoles d'O2/min/mg de protéine musculaire non-collagénique quand la relation exacte entre les variations du contenu en protéine musculaire et l'activité métabolique mitochondriale n'est pas connue ? En réalité nous ne pouvons répondre précisément à cette question. Nous pensons que les informations que nous apporte cette méthode sont insuffisantes (cf. graphique 1, et explications dans le texte p.51). C'est donc une valeur dont nous n'avons pas tenu compte dans nos conclusions.


7.1.2 A propos des Patients investigués et leurs résultats


7.1.2.1 Oxymétrie

      Nous n'avons pas pu déterminer le coefficient de contrôle chez tous les patients, ceci pour différentes raisons, le plus souvent liées à des problèmes techniques soit pendant la préparation des fibres musculaires, soit pendant les mesures oxygraphiques.

      Pendant l'étude, nous avons investigué vingt-six patients. Chez vingt-et-un patients nous avons pu calculer le coefficient de contrôle du Complexe I (21/26=80,7%), et chez vingt-trois patients, nous avons pu calculer le coefficient de contrôle du Complexe IV (23/26=88,5%).

      L'interprétation des valeurs des coefficients de contrôle s'avère difficile lorsque seul l'un des deux a pu être calculé. Les deux valeurs (complexes I et IV) ont été déterminées simultanément chez vingt-et-un patients sur les vingt six investigués (80,7%). Après analyse statistique selon Shapiro-Wilk, nous avons finalement repéré sept patients sur vingt six qui présentaient des valeurs de coefficient de contrôle en dehors de la norme (27%). L'interprétation détaillée de ces résultats a déjà été exposée.

      On peut diviser ces patients avec anomalies des coefficients de contrôle en deux catégories : ceux chez qui nous avons trouvé plusieurs éléments concordants en faveur d'une anomalie du métabolisme OXPHOS et ceux chez qui pour une raison ou pour une autre nous n'avions pas pu ou pas réussi a obtenir plus d'informations (difficultés techniques, pas assez de matériel, etc.).

      D'autre part, nous avons également défini une troisième catégorie de quatre patients chez qui un diagnostic précis a pu être posé par l'analyse histologique.

      Ces trois types de patients sont décrits ci-dessous.


7.1.2.1.1 Patients présentant des éléments concordants pour une mitochondriopathie 

      Il s'agit de deux patients : JC22.7.99, PC28.6.99.

      Patient JC22.7.99

      Cette patiente présente un tableau clinique compatible avec une ophtalmoplégie externe progressive (CPEO) et un signe indirect d'anomalie du métabolisme OXPHOS localisé au segment II-III comme pourrait en témoigner le coefficient de contrôle très abaissé pour le Complexe I. Le seul autre élément suspect est la présence d'accumulations mitochondriales sous-sarcolemmales (cf. fig. 12). On est légitimement en droit de suspecter un trouble du métabolisme OXPHOS localisé au segment II-III.

      

Fig. 12 : Coloration NADH de la biopsie musculaire de la patiente JC22.7.99 montrant une accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      Patient PC28.6.99

      Patiente qui avait déjà été le sujet de plusieurs investigations. Un document écrit mentionnait une analyse histologique effectuée dans un hôpital Universitaire à Paris et affirmait la présence de fibres RRF (red ragged fibers) dans le muscle quadricipital. Une histologie plus récente effectuée à Genève montre la présence de quelques fibres musculaires Cytochrome C oxydase (Cox) négatives (cf. fig. 13 et 14). L'analyse histologique effectuée dans le cadre de notre étude montre une prédominance de fibres de type I, riches en mitochondries (image non disponible). On note également une accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries.

      

Fig. 13 : Histologie avec coloration spécifique pour la cytochrome c oxydase (Cox) de la patiente PC28.6.99 datant de trois ans avant notre biopsie. On peut déjà distinguer quelques fibres Cox négatives.

      

Fig. 14 : Histologie spécifique pour la cytochrome c oxydase (Cox) chez la même patiente sur notre biopsie musculaire de deltoïde montrant le même aspect que sur la biopsie précédente : présence de fibres Cox négatives.

      L'analyse statistique selon Shapiro-Wilks des coefficients de contrôle montre finalement une valeur anormalement élevée pour le Complexe IV et une valeur dans la norme pour le Complexe I. Les valeurs biochimiques ne sont pas conclusives.

      Pour cette patiente il existe donc plusieurs éléments (histologie et oxymétrie) de notre étude nous permettant de fortement suspecter une anomalie du métabolisme OXPHOS localisée au Complexe IV (Cytochrome c oxydase).


7.1.2.1.2 Patients présentant des coefficients de contrôle anormaux, mais d'autres éléments discordants pour une mitochondriopathie

      Il s'agit de cinq patients : AV 17.5.99, CA26.7.99, HV29.4.99, MB31.8.99 et RM1.9.99. Seul quatre sont décrits, car HV29.4.99 est décrit sous " Patients avec un diagnostic histologique ".

      Patient AV17.5.99 

      Le seul élément anormal est un abaissement du coefficient de contrôle du Complexe I, mais qui isolé dans le contexte des autres coefficients de contrôle normaux n'a pas grande signification.

      Patient CA26.7.99 

      Le seul élément anormal est une élévation significative du coefficient de contrôle du Complexe IV. On peut raisonnablement suspecter une anomalie du métabolisme OXPHOS localisé au Complexe IV (cytochrome c oxydase). Aucun autre examen ne nous permet poser un diagnostic définitif.

      Patient MB31.8.99

      Ce patient présente non seulement une élévation significative du coefficient du Complexe I, mais aussi une accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries. On peut raisonnablement suspecter une anomalie du métabolisme OXPHOS localisé au Complexe I. Aucun autre examen ne nous permet de l'affirmer définitivement.

      Patient RM1.9.99 (cf. fig. 15 et 16)

      Ce patient présente une valeur indéniablement trop élevée du coefficient de contrôle du Complexe IV. Les autres examens sont tous dans la norme. Ce qui pourrait paraître étonnant avec un coefficient aussi grand, est l'absence de fibres Cox négatives à l'histologie alors que le muscle des expériences oxymétriques provient de la même biopsie. Encore une fois, nous ne connaissons pas la sensibilité et la spécificité de l'oxymétrie puisque aucun autre test biochimique notamment n'est capable de confirmer ou infirmer le diagnostic de mitochondriopathie.

      

Fig. 15 : Histologie de la biopsie du patient RM1.9.99. Coloration HE, muscle normal.

      

Fig. 16 : Histologie de la biopsie du patient RM1.9.99. Coloration NADH. Muscle normal.


7.1.2.1.3 Patients avec un diagnostic histologique 

      Chez ces patients, d'autres diagnostics que des mitochondriopathies sont finalement retenus.

      Patient HV29.4.99

      Ce patient avait déjà présenté une augmentation du nombre et de la taille des gouttelettes lipidiques sur une coupe histologique précédente effectuée en 1997 (cf. fig. 17). Ceci s'est encore répété sur l'histologie de la biopsie effectuée dans le cadre de notre étude (cf. fig. 18). La valeur très basse de l'activité de la carnitine musculaire vient appuyer le diagnostic de déficit primaire en carnitine chez ce patient présentant tous les symptômes typiques de cette maladie.

      

Fig. 17 : Aspect histologique d'une biopsie musculaire effectuée sur le quadriceps en 1997 chez le patient HV29.4.99.

      Remarquer l'accumulation des gouttelettes lipidiques marquées couleur rouille à la coloration ORO.

      

Fig. 18 : Aspect histologique à la coloration ORO de la biopsie deltoïde chez le même patient HV29.4.99 effectuée dans le cadre de notre étude.

      On retrouve les mêmes gouttelettes lipidiques marquées couleur rouille, augmentées en taille et en nombre.

      Ce patient présente à l'oxymétrie des valeurs très abaissées des coefficients de contrôle des Complexes I et IV. Le problème réside maintenant dans l'interprétation de ces valeurs abaissées. Théoriquement, les mesures faites avec l'oxygraphe se passent dans un milieu fermé et isolé des influences extérieures. Dans notre protocole d'expérimentation, nous utilisons des substrats et des inhibiteurs agissant directement sur les complexes respiratoires. En principe, nous arrivons donc à isoler les enzymes de la chaîne respiratoire mitochondriale impliquées dans la phosphorylation oxydative, des autres voies métaboliques comme le cycle de Krebs et la b-oxydation. Les produits de la b-oxydation entrent dans la chaîne OXPHOS au niveau du complexe II sous forme de succinate. Comment expliquer les valeurs aussi basses des coefficients de contrôle des Complexes I et IV chez ce patient ?

      Si l'on respecte le théorème de la somme, la première explication peut résider dans une anomalie du métabolisme du segment II-III de la chaîne respiratoire indépendante du déficit en carnitine. Hypothèse que nous ne pouvons pas vérifier puisque ce segment ne nous est pas accessible dans notre protocole d'étude.

      La deuxième explication pourrait être que le déficit chronique en carnitine finit par provoquer une altération compensatrice du métabolisme OXPHOS, sous forme d'une désinhibition des Complexes de la chaîne respiratoire se traduisant alors par une diminution des coefficients de contrôle : on ouvre un robinet pour compenser la fermeture d'un autre. Hypothèse que nous ne pouvons pas vérifier non plus.

      En conclusion, le diagnostic de déficit primaire en carnitine est définitivement posé chez ce patient sur la base des symptômes, de la présentation clinique et des examens complémentaires que nous avons mentionné. Nous ne pouvons que constater, sans les expliquer, les altérations des coefficients de contrôle des Complexes I et IV.

      Patient MF8.5.00

      Les examens pratiqués avant la biopsie de notre protocole d'étude n'ont pas apporté d'information utile, en particulier il n'y avait pas d'anomalie de la concentration en lactate à l'effort. Après un complément d'anamnèse révélant un phénomène de " second souffle ", le diagnostic de maladie de McArdle fût évoqué et des enzymomarquages histologiques complémentaires ont été effectués révélant effectivement l'absence de phosphorylase musculaire sur la biopsie de deltoïde (cf. fig. 19 et 20). Il s'agit d'une glycogénose de type 5 pouvant effectivement se manifester par des crampes et faiblesses musculaires à l'effort. Les patients sont incapables de cataboliser le glycogène lors d'effort anaérobie et de ce fait, on constate souvent l'absence d'élévation de lactate sanguin.

      

Fig. 19 : Il s'agit ici d'une coloration " témoin " de la myophosphorylase musculaire chez un patient " normal ".

      L'hétérogénéité s'explique par une densité plus importante de cet enzyme dans les fibres de type glycogéniques (type II).

      

Fig. 20 : Histologie du patient MF8.5.00 montrant l'absence totale de myophosphorylase.

      On distingue difficilement les travées séparant les fibres musculaires.

      Patient PP24.8.99

      Cette patiente présente une image histologique tout à fait compatible avec une sarcoïdose musculaire (cf. fig. 21). A nouveau, et comme chez le patient HV29.4.99, nous constatons une anomalie de la valeur du coefficient de contrôle d'un des Complexes respiratoires, dans ce cas précis une élévation anormale du coefficient de contrôle du Complexe I. Il est difficile de mettre ces deux observations en corrélation, puisqu'à priori la sarcoïdose, maladie granulomateuse, ne concerne pas le métabolisme OXPHOS de la mitochondrie. Il peut donc s'agir d'un faux positif, d'une anomalie primaire du Complexe I concomitante à la sarcoïdose, ou pourquoi pas, d'une anomalie secondaire à la sarcoïdose musculaire. Cette dernière possibilité n'a pourtant pas été décrite dans la littérature à l'heure actuelle.

      

Fig. 21 : Histologie de la biopsie de la patiente PP24.8.99. Coloration HE, montrant la présence d'un granulome (au centre de l'image), typique d'une sarcoïdose.

      Patient WP15.11.99

      Il vaut la peine de décrire plus en détail également le cas du patient WP15.11.99. Les résultats oxymétriques sont dans la norme d'après l'analyse selon Shapiro-Wilks. Cette patiente présente une augmentation du nombre gouttelettes lipidiques (cf. fig. 24), une accumulation sous-sarcolemmale de mitochondries, une augmentation des fibres de type I, et quelques fibres Cytochrome c oxidase (Cox) négatives (cf. fig. 22 et 23). Il a été conclu à des anomalies compatibles avec une myopathie aux corticoïdes.

      

Fig. 22 : Coloration NADH du muscle de la patiente WP15.11.99. On note une accumulation mitochondriale sous-sarcolemmale par endroits (flèche).

      

Fig. 23 : Coloration Cox de la biopsie musculaire de la même patiente WP15.11.99. On distingue quelques fibres Cox négatives.

      

Fig. 24 : Coloration ORO chez la même patiente WP15.11.99. On distingue l'accumulation des gouttelettes lipidiques.


7.1.2.2 Carnitine

      Nous l'avons déjà souligné, la dispersion des valeurs d'activité de la carnitine dans le muscle est très importante. Notre avis est donc que ce test n'est valable que lorsque la valeur d'activité de la carnitine est proche du nul et qu'il existe une concordance avec la présentation clinique et les autres examens comme l'histologie. Dans notre étude, le seul patient correspondant à ces critères a été HV29.4.99. Il présente définitivement un déficit primaire en carnitine.


7.1.2.3 Biochimie

      Nous avons pu obtenir des valeurs pour le Complexe I dans 20 cas sur 26 investigués (76.9%), pour le Complexe IV dans 21 cas sur 26 (80.7%) et pour les autres paramètres nous n'avons obtenu des valeurs que dans 7 cas sur 26 (26.9%). Ce faible rendement s'explique par le fait que les biopsies se faisaient par série de plusieurs patients et les échantillons destinés à l'analyse biochimique étaient stockés quelques semaines avant d'être envoyés à Lausanne. Ce n'est qu'après avoir biopsié une grande partie des patients investigués que nous avons constaté que le matériel stocké était insuffisant pour effectuer toutes les analyses biochimiques dans plus de 7 cas sur 10. Ceci a bien évidemment son importance puisque la fonction de chaque Complexe dépend de l'activité de l'ensemble de la chaîne respiratoire, les informations incomplètes dans ces 7 cas sur 10 rendant alors difficile une interprétation précise. Pour l'interprétation des résultats, nous avons donc essentiellement considéré les valeurs d'activités biochimiques obtenues pour les Complexes I et IV qui nous intéressaient plus particulièrement.


8. Conclusion

      Les mitochondriopathies se manifestent dans le cadre d'un déséquilibre entre " l'offre énergétique " et " la demande énergétique " à l'intérieur d'un tissu organique. Ces deux notions sont le reflet de deux effets de seuil métaboliques [3].

      Le premier effet de seuil (seuil biochimique) découle de l'hétéroplasmie, c'est à dire de la répartition entre mtDNA natif et mtDNA muté à l'intérieur d'un tissu organique. L'hétéroplasmie va déterminer les propriétés cinétiques intrinsèques des différents complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale, propriétés qui pourront être quantifiées par le calcul d'un coefficient de contrôle. Le coefficient de contrôle permet d'étudier l'effet sur le flux respiratoire mitochondrial d'une diminution proportionnelle de l'activité métabolique d'un complexe de la chaîne respiratoire. De nombreuses études sur les animaux et sur les humains ont démontré l'utilité de l'étude oxymétrique de fibres musculaires perméabilisées à la saponine dans l'étude de mitochondriopathies [13, 16, 18, 29, 41]. En appliquant la théorie du contrôle métabolique décrite dans les années 1970 par Kacser et Burns, il est possible de déterminer les valeurs des coefficients de contrôle pour différents complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale [20, 28, 31]. Expérimentalement, les coefficients de contrôle peuvent, entre autres, être déterminés par une titration aux inhibiteurs [15, 21].

      Le deuxième effet de seuil (seuil énergétique) est la conséquence de la demande énergétique propre à la fonction d'un tissu organique donné. Ainsi, la demande énergétique du système nerveux central est beaucoup plus élevée que le tissu hépatique par exemple. Une baisse proportionnellement identique de l'énergie disponible aura des effets néfastes plus importants pour le premier [3].

      Ces deux effets de seuil possèdent donc plusieurs caractéristiques pouvant être résumées de la façon suivante  [3] :

      De façon plus succincte, deux phénomènes vont être à l'origine d'une manifestation clinique d'une mitochondriopathie. D'une part, le dépassement du seuil biochimique propre à un complexe respiratoire donné, mais qui varie également selon le tissu organique dans lequel il fonctionne. D'autre part, le dépassement du seuil énergétique d'un tissu donné, résultant d'un déséquilibre entre sa demande en ATP et la production effective d'ATP dont ses mitochondries sont capables.


8.1 Flux respiratoires

      Nous avons déjà mentionné la difficulté que les autres différents groupes de recherche ont rencontrée dans leur travail dans la normalisation de la consommation d'oxygène des mitochondries à l'intérieur de la chambre d'oxymétrie. La mesure du poids humide ou sec est difficilement reproductible ce qui donne des valeurs de consommation maximale d'oxygène très dispersées pour les groupes contrôles et groupes investigués. Dans notre étude nous avons utilisé une méthode de normalisation se référant au contenu en protéines non-collagéniques des fibres musculaires récupérées à la fin de chaque mesure.


8.2 Carnitine

      Le nombre de valeurs obtenues était insuffisant pour tirer des conclusions statistiques claires (cf. p.53). Nous avons toutefois pu corréler une forte baisse du taux de carnitine mesuré dans le muscle d'un patient (HV29.4.99) et l'histologie et la clinique, concluant au diagnostic de déficit primaire en carnitine.


8.3 Histologie

      L'histologie peut s'avérer un complément d'examen très utile dans le cadre d'un bilan global d'une pathologie musculaire. Il est rare qu'à elle seule elle nous donne une information définitive sur une dysfonction métabolique du type mitochondrial. Comme nous l'avons déjà souligné, l'interprétation de l'image histologique dépend beaucoup de l'expérience du pathologue. Dans notre étude, nous avons retrouvé des anomalies histologiques chez 10 patients sur 26 (38,5%). Dans 7 cas sur 10, ces altérations n'étaient pas spécifiques : dans 4 cas il s'agissait d'accumulations sous-sarcolemmales de mitochondries, dans 3 cas il s'y associait une prédominance de fibres rapides de type I. Dans les 3 cas restants, les altérations histologiques ont permis de poser un diagnostic précis : dans 1 cas il s'agissait d'une maladie de McArdle, dans 1 cas d'une sarcoïdose, dans 1 cas d'une myopathie aux corticoïdes (patients MF8.5.00, PP24.8.99, WP15.11.99). Donc, dans 11,5% des cas (3 patients), l'histologie seule a permis de poser un diagnostic définitif. Dans les cas particuliers des patients PC28.6.99 (déficit en Cytochrome c oxydase) et HV29.4.99 (déficit en carnitine), l'histologie a été un complément très précieux dans l'aide au diagnostic. Globalement, c'est dans 5 cas sur 26 (19,2%) que l'histologie s'est révélée essentielle dans la conclusion diagnostique.


8.4 Génétique mitochondriale

      Dans aucun des cas étudiés, l'analyse du génome mitochondrial à la recherche de certaines mutations connues n'a permis de préciser un diagnostic. Ceci concorde avec une étude précédente effectuée par Magistris et Morris portant sur des biopsies musculaires à l'aiguille [42].


8.5 Biochimie

      La dispersion des valeurs d'activité biochimique étant très importante, et ces mesures se faisant " statiquement " selon la théorie de l'équilibre de la Biochimie classique, nous pensons qu'elles ne deviennent significatives que lorsqu'elles sont très basses et se corrèlent à un tableau clinique en général sévère [9].


8.6 Coefficient de contrôle

      Le coefficient de contrôle permet de quantifier le point de seuil biochimique des complexes respiratoires. Le contrôle métabolique de la chaîne respiratoire est réparti différemment selon le stade de respiration [28]. Au stade IV (disponibilité en ADP uniquement), ce paramètre dépend de la perméabilité de la membrane mitochondriale aux protons H+ [43]. Au stade III (substrats et ADP en saturation), le contrôle métabolique est réparti entre différents enzymes dont ceux de la chaîne respiratoire. Nous avons obtenu ce dernier stade pendant l'expérimentation pour nos mesures oxymétriques. Théoriquement il est possible d'obtenir plus d'informations en calculant les coefficients de contrôle de tous les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale puisque le théorème de la somme devrait pouvoir nous aider à localiser plus précisément le dysfonctionnement mitochondrial. Cependant l'analyse fonctionnelle des complexes II et III nécessite l'emploi de nombreux inhibiteurs difficiles à manipuler afin d'isoler métaboliquement ces complexes dans la chaîne respiratoire puisqu'ils se trouvent placés aux carrefours de plusieurs embranchements enzymatiques contrairement aux complexes I et IV. Cette approche s'avérait donc techniquement difficile et nous ne disposions pas du temps matériel pour l'exécution de toutes ces expériences. Des méthodes de congélation des fibres isolées pourraient pallier à ce problème.

      Le but de notre étude n'était pas de démontrer la validité de cette méthode d'analyse fonctionnelle, puisque cela a déjà été fait par d'autres groupes d'étude [13, 16, 18, 29, 41]. Notre objectif était de tester dans le cadre des consultations neuromusculaires de Genève et Lausanne, l'apport réel de cette approche au diagnostic lors de suspicion de maladie mitochondriale.

      Lorsqu'il existe une anomalie fonctionnelle d'un maillon de la chaîne respiratoire mitochondriale, celle-ci se répercute sur tous les autres maillons de la chaîne (théorème de la somme). Par exemple, si nous avons un patient présentant une valeur significativement élevée du " coefficient de contrôle " du Complexe I et une valeur à la limite inférieure pour celui du Complexe IV, on peut en conclure que la probabilité d'une anomalie fonctionnelle du Complexe I est élevée. Dans ce cas, on a une preuve directe d'une anomalie métabolique par le fait que le " coefficient de contrôle " du Complexe I est élevé et celle du Complexe IV bas. L'interprétation est plus aléatoire lorsque les Complexes I et IV possèdent des " coefficients de contrôle " à la limite inférieure de la " norme ". Dans cette situation on peut proposer l'existence d'une anomalie fonctionnelle dans le segment Complexe II-III , mais nous n'en avons pas la preuve quantifiable par le coefficient de contrôle. Nous avons tenu compte des combinaisons d'anomalie des coefficients de contrôle pour proposer des probabilités d'anomalies de tel ou tel complexe. Nous présentons les différentes possibilités dans le tableau 13.

      Nous avons ainsi pu détecter une anomalie des coefficients de contrôle des complexes I et/ou IV chez 7 patients sur les 26 investigués (26,9%). La discussion des résultats est plus particulièrement intéressante chez 2 de ces 7 patients. Notre étude a permis de préciser un diagnostic définitif de trouble OXPHOS avec une localisation précise chez ces 2 patients (7,7% de toute la population étudiée) : il s'agit une fois d'un déficit de la cytochrome c oxydase, une fois d'une probable ophtalmoplégie externe progressive (CPEO). Les autres cinq patients présentent une anomalie d'un ou des deux complexes respiratoires testés, mais aucun autre examen ne nous a aidé à confirmer l'éventuel diagnostic de mitochondriopathie. L'un de ces cinq patients (HV29.4.99) présente une clinique et des anomalies histologiques posant le diagnostic de déficit primaire en carnitine.

      Un des deux patients avec anomalie OXPHOS (PC28.6.99) peut être considéré comme patient " témoin " puisque l'augmentation importante du coefficient de contrôle du Complexe IV (Cytochrome c oxydase) concorde pleinement avec l'image histologique montrant un déficit en Cytochrome c oxydase. Chez les quatre patients présentant des éléments discordants pour une mitochondriopathie, sur la base d'une anomalie des valeurs des coefficients de contrôle associée à la présentation clinique, nous pouvons raisonnablement suspecter une dysfonction mitochondriale. Cependant, aucun autre examen ne nous permet de confirmer définitivement ce diagnostic.

      Du point de vue histologique, nous avons aussi décrit le cas particulier du patient WP15.11.99 qui présente toute une panoplie d'anomalies histologiques compatibles avec une myopathie cortisonique. En définitive, nous pouvons conclure que l'ensemble des examens fonctionnel et biologiques effectués dans le cadre de notre étude a permis de poser une diagnostic définitif chez environ 20% des patients investigués (6 patients : JC22.7.99, PC28.6.99, HV29.4.99, PP24.8.99, MF8.5.00, WP15.11.99).

      Cette étude a toutefois aussi permis d'apporter d'autres éléments de réponse dans la recherche d'une cause de dysfonctionnement musculaire chez 4 autres patients, ce qui fait un total de 10 patients. Tout type d'information confondue, notre étude a permis préciser le type de dysfonctionnement musculaire chez 38,5% des patients investigués, ce qui est un progrès considérable par rapport aux statistiques antérieures de la consultation des maladies neuromusculaires de Suisse romande.

      
Tabl. 13 : Probabilité de Dysfonctionnement des Complexes
  Probabilité de Dysfonctionnement des Complexes
  Complexe I Complexe IV Segment Complexe II-III
Ci Complexe I élevé
Ci Complexe IV normal/limite inf.
Modérée   Faible
Ci Complexe I élevé
Ci Complexe IV faible
Elevée   Très faible
Ci Complexe I et IV normal/limite inf. Très faible Très faible Très faible
Ci Complexe I faible
Ci Complexe IV normal/limite inf.
Très faible Faible ou très faible Modérée
Ci Complexe IV élevé Ci Complexe I normal/limite inf.   Modérée Faible
Ci Complexe IV élevé Ci Complexe I faible   Elevée Très faible
Ci Complexe IV faible Ci Complexe I normal/limite inf. Faible ou très faible Très faible Modérée
Ci Complexe I élevé
Ci Complexe IV élevé
Situation peu probable Situation peu probable Situation peu probable
Ci Complexe I faible
Ci Complexe IV faible
Très faible Très faible Elevée


9. Impression d'ensemble sur la Respirométrie de Haute Résolution

      Nous n'allons pas revenir sur l'utilité que nous avons pu retenir sur les différents autres examens effectués dans notre étude clinique.

      Nous allons donc plus particulièrement donner notre impression sur la méthode de l'oxymétrie de fibres musculaires perméabilisées à la saponine.


9.1 Quelques réflexions critiques sur la méthode :

      La validité des mesures oxygraphiques dans la détection des dysfonctionnements OXPHOS a été démontrée d'autres groupes de recherche comme nous l'avons déjà signalé. Cependant, les résultats de notre étude montrent qu'il n'existe pour le moment aucun moyen diagnostic définitif permettant de vérifier la véritable signification des mesures oxygraphiques et ainsi d'affirmer l'absence ou la présence d'une maladie mitochondriale chez un patient donné. Autrement dit, nous ne pouvons pas connaître la spécificité ni la sensibilité de ce test diagnostic, donc le nombre de faux positifs et de faux négatifs. L'oxymétrie et le calcul des coefficients de contrôle prennent toute leur signification dans une interprétation globale de tous les autres examens biologiques disponibles, examen clinique détaillé et anamnèse également compris. L'oxygraphie apporte donc un " plus " dans l'investigation plutôt qu'une véritable réponse.

      Ceci s'est très clairement vérifié dans le cas du patient PC28.6.99 pour lequel la clinique, les examens histologiques répétés et le calcul des coefficients de contrôle a permis de poser un diagnostic certain de dysfonctionnement métabolique mitochondrial localisé au Complexe IV. L'oxymétrie est en définitive un examen utile puisqu'il nous a permis de mieux préciser le diagnostic chez environ 38% des patients de l'étude.

      Ces résultats ont pu être obtenus grâce à un certain nombre de points importants. Tout d'abord il n'y avait qu'une seule personne en charge de la biopsie et qui, tout du moins pour les premiers prélèvements, s'occupait également de la préparation des fibres musculaires, des mesures sur l'oxygraphe et des autres mesures de protéines non-collagéniques notamment. Par la suite, ces dernières étapes ont été exécutées par un technicien en laboratoire formé spécialement pour cette occasion. Ceci nous a donc garanti la meilleure reproductibilité possible pour la méthode.

      L'appareil oxygraphique a été régulièrement testé et maintenu en bonne condition pour garantir la validité et reproductibilité des mesures. L'analyse des résultats a toujours été effectuée par la même personne et vérifiée deux à trois fois.

      On peut toutefois considérer certains " désavantages " de la méthode oxygraphique. Par exemple nous n'avions qu'un seul oxygraphe, alors que plusieurs nous auraient permis d'effectuer plus de mesures et ainsi augmenter leur validité. Ceci nous aurait également permis d'éviter de nous retrouver avec des mesures totalement ininterprétables comme cela a été le cas pour 5 patients sur 26 (19,2%). Cependant, cela aurait nécessité une plus grande équipe de travail. D'autre part, l'occupation de l'équipe de travail liée à l'oxygraphe était passablement importante et chère en temps puisqu'une seule biopsie musculaire nous tenait occupés pendant 6 à 8 heures !! Ceci sans compter toute la préparation pour les mesures ultérieures de protéines non-collagéniques que nous groupions, mais qui nous tenaient également occupés pendant toute une journée.


9.2 Quelques réflexions sur l'implication de plusieurs centres indépendants

      Pour certains examens, nous avons fait appel à d'autres centres plus ou moins éloignés géographiquement et pour qui ces examens complémentaires ne faisaient pas partie de leur activité principale. Il en a parfois résulté quelques malentendus à l'origine entre autres des mesures incomplètes pour les activités biochimiques des Complexes respiratoires en raison d'un manque de matériel musculaire. L'une des façons de remédier à ce problème serait de centraliser les examens auprès d'équipes localisées au même lieu géographique. Une autre alternative serait de mettre en culture le muscle prélevé durant la biopsie en utilisant le potentiel de réplication des cellules satellites. Malheureusement, en se répliquant, ces cellules semblent éliminer l'anomalie métabolique dont souffraient les cellules adultes [44].


9.3 Le but principal de l'étude a-t-il été atteint ?

      Nous avons la chance d'avoir détecté un patient " témoin " (PC28.6.99) qui nous permet de valider la méthode de l'oxygraphie puisque d'autres examens confirment le diagnostic de dysfonctionnement mitochondrial localisé au Complexe IV (Cytochrome c oxydase). Par ailleurs, l'oxymétrie nous a permis de préciser le diagnostic dans 38,5% des cas investigués. Au regard de ces données, notre étude ne nous permet pas d'affirmer que l'oxymétrie est une méthode diagnostique plus sensible que les autres examens, mais elle s'est révélée hautement utile dans l'éclaircissement de pathologies touchant le métabolisme musculaire.

      Il s'agit toutefois d'un exercice coûteux et qui ne prend sa signification que dans le contexte d'un centre neuromusculaire pluridisciplinaire intéressé aux mitochondriopathies avec une équipe de recherche sur les maladies mitochondriales. Car ce n'est qu'ainsi qu'on pourra progresser dans les corrélations entre examens et pathologie, et par conséquent dans les approches thérapeutiques.

      Antonio A. Faúndez

      Novembre 2003


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