Coloration au DAPI (4’,6’-Diamidino-2-phénylindole - 2HCl)
Le DAPI est un fluorochrome qui se complexe sélectivement avec l’ADN double brin, au niveau du petit sillon, pour donner une fluorescence aux environs de 460 nm lors d’une excitation vers 350 nm. Il se lie préférentiellement avec les séquences riches en A-T. Il se lie aussi à l’ARN mais d’une manière différente, probablement au niveau des séquences A-U. Le complexe DAPI/RNA montre une λ d’émission de fluorescence maximum supérieure à celle du complexe DAPI/DNA double brin (~500 nm) et un rendement de fluorescence plus faible.
La λ maximum d’excitation du DAPI lié à l’ADN double brin est de 358 nm (violet) et la λ maximum d’émission est de 461 nm (bleu).
Voir protocole de coloration ci dessous.
Procédure de coloration de coupes paraffine (8 μm)
- Déparaffinage et réhydratation des coupes
- Diluer la solution stock de DAPI à la concentration voulue : entre 0.1 mg/ml et 1 mg/ml.
- Déposer une goutte de colorant sur les coupes après les avoir éventuellement entourées d’un trait au crayon de diamant, pour
éviter l’étalement de la goutte.
- Laver 3 x 5 min à l’eau distillée.
- Monter les coupes entre lame et lamelle dans du Vectashield
- Observer les coupes, au microscope à fluorescence, avec les filtres appropriés. Sur le Leica DMI RE2 le bloc de filtres utilisé
se compose : d’un filtre d’excitation dans les UV (340 – 380 nm)
du miroir dichroïque 400 nm
d’un filtre barrière qui laisse passer les λ supérieures à 425 nm (LP 425 nm).
Microphotographies de portions de coupes paraffine réalisées
dans l'extrémité d'une racine primaire de Zea mays
Détail d'une mitose - telophase
Microphotographies de portions de coupes paraffine
réalisées dans un nodule racinaire induit par NGR234
