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Mise en évidence des polysaccharides au niveau ultrastructural (Microscopie électronique à transmission) par la méthode PATAg

Ci contre portions de coupes ultrafines (80 nm) réalisées dans une racine jeune de Zea mays et colorées au PATAg pour la mise en évidence des polysaccharides: 
En haut : aspect de quelques cellules montrant que les grains d'amidon des amyloplastes et les parois sont denses aux électrons (réaction positive au test PATAg).
Au milieu : détail d'une paroi séparant deux cellules et amyloplastes avec les grains d'amidon fort denses aux électrons (ga).
En bas: paroi et grain d'amidon à fort Gx

ga: grain d'amidon; a: amyloplaste; p: paroi; V: vacuole; N: noyau

Prises  de vue: microscope électronique Philips EM 410; FEI TECNAI TM G2 Sphera

Principe de la coloration "PATAg" pour Periodic Acid Thiocarbohydrazide Argent

Il s'agit d'une méthode de visualisation spécifique des polysaccharides à l’échelle ultrastructurale en les contrastant. Elle comporte 3 étapes principales:
La première étape est une oxidation par l’acide périodique des fonctions vic- glycols (vic: vicinales; glycols: alcool primaires portés par les cycles osidiques) qui fait apparaûtre des fonctions aldéhydes.
La seconde étape consiste en un traitement des coupes par le thiocarbohydrazide (TCH) qui se condense sur les fonctions aldéhydes.
Dans la 3ème étape les coupes sont traitées au protéinate d'argent qui donne lieu à la formation de précipités d'argent métallique denses aux électrons.

Protocole:
Appliqué à des coupes ultrafines (80 nm) réalisées dans des tissus préparés selon la méthode standard de double fixation glutaraldéhyde - OsO4 et enrobage epon. Les coupes sont récupérées sur des grilles d’or recouvertes de formvar. Les grilles sont successivement :

  • Déposées à la surface de gouttes (~ 30 µl) d'acide  périodique 1%, pendant 20 minutes à T° ambiante. Des grilles témoin sont déposées à la surface de gouttes  (~ 30 µl) d’ H2O2 5%, pendant 20 minutes à T° ambiante
  • Rincées  4 x 5 minutes sur des gouttes successives (~ 50 µl) d'H2O distillée
  • Déposées à la surface de gouttes de 50 µl d’une solution de TCH 0,2%, dans une chambre humide, à l’obscurité, pendant 30 minutes à 72 h,  selon le matériel. Il convient de contrôler régulièrement que les gouttes ne sèchent pas.
  • Lavées par passages sur des gouttes d’acide acétique de moins en moins concentré :20 % (4 x 5 min),10% (5 min),5% 5 min, 2% 5 min et 1% 5 min).
  • Rincées par passages sur des gouttes d’H2O milliQ filtrée (Millipore) 5 x 5 min
  • Déposées à la surface d’une goutte de protéinate d'argent 1%, pendant 30 min à T° ambiante, à l'obscurité
  • Lavées de nouveau par 4 passages sur de l'eau distillée
  • Séchées et observées au microscope électronique à transmission.

PATAg coiffe racine Zea .

Localisation des polysaccharides (test PATAg)

Ci dessous aspect à fort Gx d'un grain d'amidon (échelle: 1000 nm)

detail PATAg.jpg

 

Gallerie des microphotographies de la coloration PATAg

    Michèle Crèvecoeur
Microscopie des plantes

Email:
michele.crevecoeur@unige.ch

Mise à Jour : 31 mars 2022