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Cryofracture

La technique de cryofracture a été développée par Moor et al en 1961. Elle consiste en une congélation rapide de l’échantillon biologique qui est ensuite fracturé à basse température. Une empreinte de la surface de fracture est ensuite réalisée et observée au microscope électronique à transmission. Cette technique permet donc de réaliser une empreinte topographique d’un échantillon congelé. On peut ajouter une étape de dessication de la surface fracturée par sublimation de la glace et on parle alors de cryodécapage

Préparation des échantillons.
L’échantillon biologique est congelé aussi rapidement que possible. Lorsque la t° tombe en dessous du point de congélation, l’eau d’imbibition générale de la matière vivante cristallise in situ en de nombreux micro cristaux. Ceux- ci peuvent causer des dommages structuraux, notamment déchirer es diverses membranes cellulaires. Une grande rapidité de congélation évite en partie la formation de ces cristaux. On peut aussi protéger l’échantillon de tels dommages par un prétraitement par un agent qui fonctionne comme antigel comme par exemple la glycérine, utilisée le plus souvent en solution aqueuse à 25%. Et pour éviter une éventuelle plasmolyse des cellules par suite du traitement à la glycérine on préfixe les échantillons à la glutaraldéhyde.
Il est à noter que la préparation des échantillons varie en fonction de la teneur en eau des tissus. D’une manière générale la fixation par le froid de tissus dont le teneur en eau varie entre 50 et 80% fournit de bonnes images après fixation à la glutaraldéhyde à 4% et traitement à la glycérine à 25%.   Pour des échantillons de teneur en eau très basse comme par exemple des embryons de graines non germées (teneur en eau de 5 - 10%) et les embryons de graines germés quelques heures (20 à 45%) des concentrations de glycérine et de glutaraldéhyde de 50% fournissent de très bonnes images comparables à celles obtenues pour des échantillons bien hydratés.

Fracture des échantillons congelés.
Les échantillons sur leur support sont placés dans un appareil Balzers BA 360 M à -100°C sous un vide poussé. Ils sont fracturés à l’aide d’un microtome équipé d’une lame Eversharp-shick et refroidi par un flux d’azote liquide. Le matériel congelé se brise sous la poussée de la lame qui l’entaille de manière superficielle. Selon le niveau de fracture il est possible d’examiner la surface externe de l’échantillon, des structures internes de celui-ci ou encore les membranes cellulaires vues en surface.
Les fractures les plus fréquentes se font au niveau des membranes plus spécialement dans les zones hydrophobes des phospholipides, zones de moindre résistance lors de la fracture du matériel congelé (voir ci contre). Les membranes sont clivées dans le sens de leur épaisseur et leurs surfaces internes (FI) peuvent être observés. 

Faces membranaires

Site Clivage des membranes.jpg

La ligne de fracture (trait épais) passe dans l’épaisseur de la membrane (zone de moindre résistance). Elle peut mettre en évidence deux faces distinctes désignées selon la nomenclature publiée par Branton et al. (1975) : la face EF correspond à la moitié de la membrane qui reste attachée à l’espace extracellulaire (paroi cellulaire dans la cellule végétale) après fracture et la face PF (face protoplasmqiue) celle qui reste attachée au cytoplasme. 

Ombrage
Les détails des structures mises à nu par la fracture du matériel congelé sont recouverts par l’évaporation à -100°C d’une très fine pellicule de carbone – platine. La source d’évaporation est disposée latéralement par rapport à l’échantillon. Les structures de l’objet fracturé présentant un relief il s’en suit que les parties de l’échantillon disposées vers la source d’évaporation vont être recouvertes d’une couche de carbone - platine et apparaitront denses aux électrons. En revanche celles qui sont opposées à la source se trouvent à l’abri de ce dépôt et lors de l’observation au microscope électronique ces zones laisseront passer beaucoup plus d’électrons et apparaitront en blanc.
Ci contre principe de l'ombrage d'après Robards (1970) in "Electron Microscopy and plant ultrastructure". Ed McGraww Hill.
a : évaporation de métal à partir d'un filament sur un échantillon.
b : proportion d'électrons qui atteindront l'écran du microscope électronique selon la zone de l'échantillon.

Pt C sur replique

A droite micrographie électronique d'une portion de réplique de racine de maïs illustrant l'ombrage au niveau d'une structure cellulaire de type globulaire (G).  Les zones qui ont été exposées à l'évaporation apparaissent sombres c.à.d denses aux électrons pour l'observateur (ZS : zone sombre) et les zones à l'abri de la source apparaissent claires (ZC, ombre projetée). Cette distinction zones claires - zones sombres s'applique à toute structure cellulaire qui présente un relief qu'elles soient de grande taille (S ci contre) ou de petites tailles comme les protéines intra-membranaires (ci dessous).

Une flèche indiquant la direction générale de l'ombrage est toujours indiquée sur chaque micrographie et est essentielle pour la reconnaissance des faces membranaires exposées par la fracture du matériel congelé.

A droite détail d'une portion de la surface de la membrane plasmique avec les protéines. Elles apparaissent comme des structures globulaires denses aux électrons avec leur ombre projetée en forme de cône blanc.

Illustration ombrage 2.jpg

Illustration ombrage

 

Illustration ombrage protéines

Confection de la réplique.
Après ombrage C - Pt une mince couche de C est déposée à la surface de l’échantillon, de manière verticale. Cette couche de C et celle de C - Pt de l’ombrage constituent la réplique.

Nettoyage de la réplique
Après confection de la réplique le vide est cassé dans l'appareil Balzers et l'échantillon retiré et mis à dégeler à t° ambiante. Les porte objets sur lesquels les échantillons recouverts de leur réplique sont plongés délicatement dans une solution d'acide sulfurique 10% et conservés à l'abri des poussières. Ils sont ensuite plongés dans de l'acide sulfurique à 75% afin de dissoudre complètement les restes d'échantillon biologique. Les répliques dissociées de l'échantillon sont récupérées et lavées dans de l'eau bi distillée puis 12h dans de la Javel. Après plusieurs lavages à l'eau bi distillée elles sont montées sur des grilles en cuivre de 200 - 300 mesh selon leur taille et observées au MET.

Micrographies des faces de la membrane plasmique, de l'enveloppe nucléaire et du Golgi dans des racines de maïs et dans le méristème de tige d'épinard après cryofracture.

    Michèle Crèvecoeur
Microscopie des plantes

Email:
michele.crevecoeur@unige.ch

Mise à Jour : 31 mars 2022