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Formation de nodosités fixatrices d’azote sur les racines des plantes

La fixation de l’azote se déroule à l’intérieur d’organes végétaux spécialisés appelés nodosités (ou nodules) qui se forment sur les racines des légumineuses. Dans ces nodosités, les rhizobia transforment l’azote atmosphérique (N2) en ammonium (NH4+), grâce à l’action de l’enzyme nitrogénase. En échange de cet azote réduit qui est rapidement assimilé par la plante, celle-ci fournit aux rhizobia des produits dérivés de la photosynthèse (acides dicarboxyliques) qui permettent de produire l’énergie requise pour le fonctionnement de la nitrogénase (Oldroyd et al. 2011). Or les nodosités ne se développent que lorsque les plantes hôtes se trouvent au contact immédiat de rhizobia symbiotiques. Et pour obtenir une symbiose efficace, il faut que les rhizobia non seulement gagnent l’intérieur des racines mais réussissent aussi à infecter de manière chronique l’intérieur de cellules végétales qui forment les nodosités. Ce n’est qu’une fois à l’intérieur de ces cellules que les rhizobia se transforment alors en bactéroïdes capables de réduire l’azote. Le processus infectieux qui conduit les rhizobia jusqu’aux cellules hôtes est caractérisé par un échange de signaux moléculaires entre bactéries et plantes hôtes (Perret et al. 2000, Gibson et al. 2008). Parmi ces signaux, le cocktail de flavonoïdes exsudés par les racines d’une légumineuse est essentiel pour débuter l’interaction avec les rhizobia.
                

nodosites

Développement de nodosités fixatrices d’azote. A, racines de Vigna radiata couvertes de nodosités. B, nodosités de Vigna unguiculata 36 jours après l’inoculation de la bactérie Sinorhizobium fredii NGR234. C, coupe transversale d’une nodosité avec en son centre et colorée en rose par la leghémoglobine, la zone des cellules végétales qui contiennent les rhizobia. Principales étapes du processus de formation et d’infection des nodosités: D, les rhizobia (rz) induisent la courbure de poils absorbants (rh), et forment un centre d’infection (ic) puis un cordon d’infection (it); E, en progressant en direction du primordium nodulaire (np) constitué de cellules végétal du cortex qui sont entrées en division (c), le cordon d’infection se ramifie (rit); F, à l’extrémité du cordon d’infection (it), les rhizobia (rz) sont libérés dans le cytoplasme d’une cellule de la nodosité où ils se différencient en bactéroïdes (bc). Dans le cytoplasme végétal, un ou plusieurs bactéroïdes entourés par une membrane végétale péribactéroidienne forment un «symbiosome» (s).

Symbioses rhizobia-légumineuses : entre promiscuité et spécificité

Le processus qui permet la formation de nodosités fixatrices d’azote est généralement très spécifique : les légumineuses sélectionnant avec soin parmi les millions de bactéries présentes dans le sol, celles avec lesquelles elles entreront en symbiose (Masson-Boivin et al. 2009). Cette spécificité d’hôte ainsi que la compétition entre bactéries qui colonisent les systèmes racinaires des plantes, limitent souvent l’efficacité en champs d’inoculants bactériens (bio-inoculants) préalablement sélectionnés pour leurs propriétés symbiotiques. En effet, il n’est pas rare qu’une souche (un type) de rhizobia ne soit véritablement efficace que sur certaines espèces ou variétés végétales et/ou qu’elle soit surpassée par les rhizobia indigènes au sol où elle sera introduite. Beaucoup des signaux qui permettent aux légumineuses et bactéries symbiotiques de se « reconnaître » sont maintenant connus. Toutefois, les mécanismes qui permettent à une souche d’être plus efficace qu’une autre sur une plante hôte restent encore mal compris. Afin d’élucider ces mécanismes, notre groupe explore deux axes de recherche principaux :

1. Elucider les bases génétiques qui permettent à la souche bactérienne Sinorhizobium fredii NGR234 de former des symbioses fixatrices d’azote avec plus de 135 espèces de légumineuses, ce qui est une gamme d’hôte exceptionnelle.

2. Sonder la diversité des rhizobia en champs ou dans d’autres écosystèmes afin d’isoler puis caractériser de nouvelles souches aux propriétés symbiotiques particulières.

1. Sinorhizobium fredii NGR234 possède un spectre d’hôte très étendu

Parmi les rhizobia qui sont étudiées en laboratoire, la souche NGR234 possède le spectre d’hôte le plus étendu. NGR234 induit la formation de nodosités sur les racines de plus de 120 genres de légumineuses, et fixe l’azote avec plus d’une centaine d’espèces différentes (Pueppke & Broughton, 1999). Notre groupe cherche à identifier quelles sont les caractéristiques moléculaires (les gènes et leurs fonctions) qui confèrent à NGR234 ce spectre d’hôte aussi étendu. Plus particulièrement, nous souhaitons :

(a) déchiffrer les clefs du dialogue moléculaire entre NGR234 et ses plantes hôtes,

(b) vérifier si la fixation de l’azote dans les nodosités d’autant d’espèces différentes nécessite une adaptation de NGR234 à chacun de ces environnements, et

(c) déterminer les fonctions et l’importance relative des gènes qui sont spécifiquement exprimés lorsque NGR234 se trouve à l’intérieur des nodosités.

Afin de répondre à ces questions nous avons entrepris les analyses suivantes:

(a) Lorsque NGR234 se trouve au contact d’une plante hôte, les flavonoïdes exsudés par les racines stimulent une cascade d’activation génique qui contrôle la transcription de plus de 70 gènes (Kobayashi et al. 2004). Parmi ces gènes se trouvent ceux impliqués dans la formation d’un système de type III pour la sécrétion des protéines (T3SS). Initialement décrits chez des bactéries pathogènes de plantes ou d’animaux, le fait qu’un T3SS était impliqué dans le contexte des symbioses rhizobia-légumineuses a été une surprise (Viprey et al. 1998). Par la suite, plusieurs techniques dont celle du « phage display » ont été nécessaires pour identifier les protéines effectrices Nop nodulation outer proteins ») qui sont sécrétées par le T3SS, dont NopP (Ausmees et al. 2004). Chez NGR234, l’activité du T3SS mais aussi la modification chimique de plusieurs composés de la paroi bactérienne, sont placées sous le contrôle du régulateur de la transcription TtsI (Viprey et al. 1998, Marie et al. 2004). Plus récemment, grâce à la séquence complète du génome de NGR234 (Freiberg et al. 1997, Schmeisser et al. 2009) et des données de séquençage à haut débit d’ARN (RNA-Seq) (Huyghe et al. 2015), nous avons identifié de nouveaux facteurs qui modulent le processus d’infection des racines par NGR234.

               

RNAseqTMAP

Analyse du transcriptome de NGR234 par RNA-Seq. Exemples de profils d’expression de gènes dans des cellules de NGR234 préparées à partir de cultures cellulaires libres sans (A) ou avec (B) flavonoïdes, ou (C) de nodosités de la plante hôte Vigna unguiculata. Comme exemple caractéristiques, nous avons sélectionné les profils des gènes rpsL, nodA et nifH1. Le premier (rpsL) est un gène domestique exprimé de manière constitutive, le second (nodA) est placé sous le contrôle de la cascade régulatrice activée par les flavonoïdes, et le troisième (nifH1) code pour un des composants de l’enzyme nitrogénase.

 

(b) Afin de mieux caractériser les bactéroïdes de NGR234, nous avons entrepris plusieurs travaux dont : (i) une description des réseaux de régulation géniques actifs dans les nodosités (Perret et al. 2003), (ii) une caractérisation moléculaire des bactéroïdes de NGR234 (N. Bakkou 2011), et (iii) une analyse comparative du protéome des cellules de NGR234 isolées à partir de cultures liquides ou de nodosités récoltées sur les racines de différentes plantes hôtes.

(c) Plusieurs travaux montrèrent que le plasmide symbiotique de NGR234 (appelé pNGR234a) porte plus de 50 gènes qui sont spécifiquement exprimés dans les bactéroïdes lorsque ceux-ci fixent l’azote pour le bénéfice des plantes hôtes (Freiberg et al. 1997, Perret et al. 1999, Perret et al. 2003). Parmi ces gènes se trouvent ceux qui codent pour l’assemblage de la nitrogénase et assure son fonctionnement : ce sont les gènes nif et fix . Avec les récentes données de transcriptomique obtenues par RNA-Seq, il est apparu que plusieurs gènes du chromosome et mégaplasmide (pNGR234b) contribuent aussi au processus de fixation de l’azote (Huyghe et al. 2015). Toutefois, la grande majorité des loci spécifiquement exprimés dans les bactéroïdes est placée sous le contrôle des régulateurs de la transcription NifA et BxqH (N. Bakkou 2011). Afin de faciliter la mutagénèse et l’étude des gènes placés sous le contrôle de NifA, un nouveau transposon TnEKm-PwA a été développé (Fumeaux et al. 2011). Etonnamment, cette étude montra que les gènes nifQ et dctA1 que l’on pensait indispensables au fonctionnement des bactéroïdes, ne l’étaient pas.
                

FixationSymbiotique

Génétique de la fixation de l’azote chez NGR234. A, carte génétique d’une partie des 536 kb de pNGR234a qui code pour des gènes de la fixation de l’azote dont NifA, le régulateur clef de la transcription des gènes nif et fix. B, plantes de V. unguiculata infectées avec la souche de référence NGR234 ou une souche mutante (NGR∆nifA) incapable de fixer l’azote. C, deux nodosités de V. unguiculata infectées avec une souche de NGR234 marquée avec Gus. D, analyse comparative du protéome de cellules de NGR234 en culture libre (haut) ou isolées à partir de nodosités fixatrices d’azote de V. unguiculata (bas).            

2. Identification des rhizobia par spectrométrie de masse

Les rhizobia forment un groupe très hétéroclite de bactéries du sol dont les propriétés génétiques et physiologiques sont particulièrement diverses (Masson-Boivin et al. 2009). Cette diversité phénotypique complique l’isolement et la caractérisation moléculaire de nouvelles souches symbiotiques, et les méthodes classiques de microbiologie sont souvent fastidieuses, longues et peu adaptées à des procédures de criblage à grande échelle. Afin de faciliter le processus d’identification de nouvelles souches de rhizobia, nous avons développé un protocole qui permet de rapidement caractériser par spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS) les bactéries qui sont établies à l’intérieur d’une nodosité (Ziegler et al. 2012). Ainsi, à partir d’une fraction des bactéroïdes contenus dans une nodosité, il est maintenant possible d’obtenir une empreinte qui est à la fois spécifique à la souche bactérienne, très reproductible, et qui ne varie pas en fonction de la plante hôte à l’origine de la nodosité. Par ailleurs, les empreintes spectrométriques obtenues à partir de bactéries cultivées sur ou dans des milieux de croissance synthétiques possédant les mêmes caractéristiques que celles obtenues à partir de nodosités, il est dès lors possible d’établir un catalogue d’empreintes spécifiques à chacune des souches de rhizobia connues.

 

SSP

Exemple d’une empreinte MALDI-TOF MS pour NGR234. Les signaux obtenus sont traduits en masses représentatives (traits pointillés) qui, ensemble, forment un véritable code-barres qui est unique et spécifique pour la bactérie analysée.

 

En collaboration avec la société Mabritec AG (Suisse), les empreintes de plus d’une centaine de souches de rhizobia isolées à partir de nodosités de plus de 70 plantes hôtes et récoltées dans 30 pays, ont été assemblées dans une seule base de données (Ziegler et al. 2015). Il est dès lors devenu possible d’assigner à un genre, une espèce, ou même une souche de rhizobia déjà répertorié les bactéroïdes à priori inconnus qui sont isolés à partir de nodosités collectées en champs. Cette nouvelle méthode d’identification de rhizobia, qui a été testée avec succès sur des nodosités du pois d’Angole (Cajanus cajan) collectées dans des champs de Côte d’Ivoire (Fossou et al. 2016), est maintenant utilisée pour sonder la diversité des bactéries symbiotiques du Fenugrec (Trigonella foenum-graecum) en Tunisie. Cette nouvelle méthode d’identification et de caractérisation des rhizobia ouvre ainsi la porte à des études beaucoup plus exhaustives pour explorer la diversité et compétitivité des populations de bactéries symbiotiques, que cela soit dans des champs de légumineuses ou d’autres biotopes.

 

cc

Collecte de nodosités de pois d’Angole en Côte d’Ivoire. A gauche, des plants de Cajanus cajan cultivés dans un champ proche de Yamoussoukro, et à droite des nodosités observées sur les racines d’une plante déterrée d’un champ dans la localité de Koussou-Bouafla.



       

Références bibliographiques

 

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