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Nous cherchons à comprendre les mécanismes de l'apoptose en élucidant les changements structurels et le réseau d'interaction des protéines de la famille Bcl-2 (B-Cell Lymphoma-2) dans un environnement artificiel et natif lors du déclenchement de l'apoptose.

La voie mitochondriale (intrinsèque) de l'apoptose est régie par l'interaction de trois protéines différentes de la famille Bcl-2 avec des effets compétitifs et/ou synergiques ; i) Le stimulus apoptotique est reçu et transmis par les protéines BH3 uniquement (Bid, PUMA), qui régulent l'interaction des autres partenaires ; ii) Les membres pro-apoptotiques de la famille (Bax, Bak) perméabilisent la membrane lors d'un stimulus apoptotique ; iii) Les membres anti-apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xL) inhibent la perméabilisation de la membrane.

Pour élucider le réseau d'interaction complexe de la famille Bcl-2, nous utilisons la EPR par marquage de spin dirigé vers le site pour cartographier les changements structurels des protéines impliquées et leurs interactions au niveau des membranes artificielles et natives. Bien que les liposomes artificiels soient utiles pour étudier les interactions entre protéines in vitro, les effets physiologiques d'encombrement et les protéines associées à la membrane peuvent modifier le réseau d'interaction dans les organites. Pour travailler dans des conditions aussi natives que possible, nous utilisons des mitochondries isolées du foie de souris. Nous utilisons des méthodes de EPR à onde continue et de dipôle pulsé en combinaison avec des marqueurs orthogonaux pour suivre simultanément différents partenaires d'interaction.

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Collaborateurs:

Prof. Ana GARCIA-SAEZ, University of Cologne, Germany

 

Points forts de la publication:

The first model of one Bax dimer at the membrane:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276514007795?via%3Dihub

 

Orthogonal labels on Bcl-2 proteins

https://www.nature.com/articles/s41598-019-49370-z

 

Les transporteurs ABC se divisent en importateurs, présents exclusivement chez les bactéries, et en exportateurs, présents dans tous les phyla de la vie. Les processus de transport médiés par plus de quarante exportateurs ABC humains remplissent des fonctions vitales dans notre corps, car ils transloquent une gamme extraordinairement large de cargaisons telles que des lipides, des peptides, des ions et des médicaments à travers des bicouches lipidiques. Un certain nombre de maladies héréditaires graves, dont la mucoviscidose et les troubles de la sécrétion d'insuline tels que le diabète néonatal et l'hyperinsulinisme, sont directement liés à un dysfonctionnement des transporteurs ABC (CFTR et SUR1, respectivement), ce qui souligne leur importance capitale pour la santé humaine. Les exportateurs ABC humains P-glycoprotéine, ABCG2 et MRP1 agissent comme des pompes d'efflux multi-médicaments dans les tumeurs et entravent le traitement efficace du cancer.

Les exportateurs ABC se composent au minimum de deux domaines transmembranaires (TMD) contenant chacun six hélices transmembranaires qui s'avancent loin dans le cytoplasme et de deux domaines de liaison aux nucléotides (NBD), qui subissent d'importants changements de conformation en réponse à la liaison et à l'hydrolyse de l'ATP. Le transport à travers la membrane nécessite la liaison du substrat à la cavité tournée vers l'intérieur, la fermeture du NBD et la transition vers l'état tourné vers l'extérieur (OF) et la libération du substrat.

Dans notre laboratoire, nous étudions l'ensemble du cycle de transport à l'aide de techniques de EPR. Les mesures de distance par résonance électronique double (DEER) et les techniques de polarisation nucléaire dynamique d'Overhauser sont particulièrement utiles pour notre objectif. Les sondes de spin paramagnétiques sont fixées au site d'intérêt, ce qui nous permet de mesurer avec précision la distance entre les paires d'étiquettes de spin et/ou d'étudier l'accessibilité et la dynamique de l'eau autour de la sonde de spin.

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Collaborateurs:

Prof. Markus SEEGER, University of Zurich, Switzerland

Prof. Lars SCHAEFER, Ruhr-University Bochum, Germany

Prof. Arne MOELLER, University Osnabrück, Germany

 

Points forts de la publication:

Spin-labeled nanobodies as conformational reporters:

https://www.pnas.org/content/117/5/2441.full

 

Exploring conformational equilibria of a heterodimeric ABC transporter:

https://elifesciences.org/articles/20236.pdf

La séparation de phase liquide-liquide est un phénomène physico-chimique intriguant qui est lié à l'équilibre thermodynamique entre deux phases liquides apparaissant dans les solutions de protéines : les protéines isolées en solution coexistent avec des condensats moléculaires. Des preuves émergentes suggèrent que le LLPS pourrait sous-tendre la formation d'organelles sans membrane dans les cellules eucaryotes.

Dans notre nouveau projet, nous avons commencé à étudier le début du LLPS de la protéine du γ‑ cristallin en utilisant les marqueurs de spin nitroxyde comme indicateurs de la dynamique des chaînes latérales pour comprendre la modification des propriétés dynamiques des résidus de surface lors de la formation des gouttelettes. Les mesures de distance seront également utilisées pour surveiller les changements de structure et pour suivre les interactions avec les cosolutés et les partenaires protéiques ou DNA/RNA.

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Collaborateurs:

Prof. Roland WINTER, Technical University Dortmund, Germany

Prof. Lars SCHAEFER, Ruhr-University Bochum, Germany

Prof. Martina HAVENITH, Ruhr-University Bochum, Germany

 

Points forts de la publication:

Changes in side-chain dynamics and water hydration at the onset of LLPS

en préparation

La EPR par marquage de spin dirigé vers le site, combinée à la spectroscopie dipolaire à impulsions, permet d'étudier la structure et les changements de conformation des protéines in vitro avec une grande sensibilité. La taille et l'environnement des protéines n'ont pas d'impact sur la sensibilité de la méthodologie EPR; par conséquent, nous pouvons étudier les petits peptides (jusqu'à quelques acides aminés) et les grandes protéines (jusqu'au mégadalton, voir le projet sur les toxines) et nous pouvons utiliser des environnements imitant les membranes tels que les micelles, les liposomes, les nanodisques ou les vésicules internes d'E. coli pour stabiliser les protéines membranaires.

Cependant, notre objectif est de mieux comprendre la structure, les interactions et la fonction d'une protéine dans son environnement physiologique, à savoir la cellule. À cette fin, nous marquons les protéines hydrosolubles produites par recombinaison avec des marqueurs biocompatibles et nous les incorporons dans les cellules à une concentration physiologique (jusqu'à des centaines de nanomolaires par cellule). En extrayant les contraintes de distance dans les cellules, nous pouvons créer des modèles à gros grains de leurs changements de conformation et caractériser leurs interactions avec d'autres partenaires.

Dans le but d'observer les mouvements d'une protéine membranaire dans sa bicouche, nous avons été les premiers à utiliser des nanocorps marqués au spin comme indicateurs de conformation des protéines membranaires dans les cellules.

Pour les protéines Bcl-2, nous avons choisi d'utiliser des mitochondries fraîchement isolées de foie de souris pour fournir le milieu physiologique où se produit l'oligomérisation de Bax (voir le projet apoptose) au début de l'apoptose.

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Points forts de la publication:

Nanomolar DEER sensitivity in cell:

 

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jpclett.1c00048

 

Spin-labeled nanobodies as conformational reporters for membrane proteins

 

https://www.pnas.org/content/117/5/2441/tab-article-info

 

Les toxines présentent un intérêt biochimique général car elles peuvent être utilisées comme armes biologiques (par exemple, les biopesticides) ou pour des applications biopharmaceutiques. Les toxines Tc sont des complexes protéiques de 1,7 MDa que l'on trouve dans les bactéries pathogènes pour les insectes et l'homme. Le complexe se compose de trois sous-unités : le pentamère TcA de 1,4 MDa, qui assure l'association avec la cellule cible, l'insertion dans la membrane et la translocation de la toxine, et deux sous-unités plus petites, TcB et TcC, qui forment un cocon de 250 kDa qui encapsule une enzyme toxique. La transformation de la toxine d'un état de prépores à un état de pores et la libération concomitante de l'enzyme sont commandées par le pH.

Nous étudions la cinétique de la transition de l'état prépore à l'état poreux d'une toxine Tc in vitro par spectroscopie EPR à onde continue et DEER. En outre, nous étudions le couplage allostérique induit par des mutations ponctuelles. Nous utilisons une approche intégrative combinant la EPR avec des méthodes de cryo-EM et de fluorescence de molécules uniques.

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(adapté de https://doi.org/10.1038/s41586-018-0556-6)

Collaborateurs:

Prof. Stefan RAUNSER, Max Planck Institute of Molecular Physiology, Dortmund, Germany

Prof. Claus SEIDEL, Heinrich Heine University Düsseldorf, Germany

 

Les changements de conformation des protéines sont étroitement liés aux réarrangements des molécules d'eau qui les entourent. Plusieurs techniques expérimentales sont disponibles pour extraire des informations sur l'accessibilité à l'eau des sites protéiques marqués au nitroxide. Chaque méthode a ses propres avantages et inconvénients. La saturation de puissance CW peut être réalisée à température ambiante après l'ajout d'agents paramagnétiques se répartissant dans l'eau ou dans l'environnement membranaire pour étudier la topologie des protéines ; l'ESEEM est réalisée sur des échantillons congelés contenant de l'eau deutériée dans le solvant pour extraire l'accessibilité de l'eau ; l'analyse du spectre CW à haut champ sur des échantillons congelés fournit les paramètres des tenseurs g et A qui sont sensibles à la polarité et à la proticité du microenvironnement du nitroxyde.

Nous concentrons sur la polarisation nucléaire dynamique d'Overhauser (ODNP), une méthode mixte NMR-EPR qui permet d'extraire l'accessibilité à l'eau des chaînes latérales marquées au nitroxyde dans les protéines à température ambiante. L'ODNP peut être réalisée sur quelques microlitres d'échantillon à un champ magnétique de 0,33 T (bande X). Nous mesurons le transfert de la polarisation du spin électronique vers les spins nucléaires couplés via la relaxation croisée en détectant le changement induit par les micro-ondes dans l'intensité du spectre NMR du proton de l'eau à une fréquence de Larmor d'environ 14 MHz. Nous explorerons le potentiel de l'ODNP pour surveiller les changements d'hydratation pendant les changements de conformation des protéines, les réarrangements des cavités d'eau dans les biomolécules et la protection de l'eau lors de la liaison avec la membrane.

 

Collaborateurs:

Prof. Song-I HAN, UCSB, California, US