Domaines de compétences : microscopie, histo/cytologie, histo/cytochimie, anatomie végétales

Les années passées à l'université m'ont permis de me spécialiser et d'acquérir de l'expérience de techniques très diverses dans le domaine de la microscopie appliquée à l'étude des plantes. Ces techniques reprises ci dessous ont été développées pour des collaborations à divers projets de recherche de laboratoires du département de Botanique et Biologie Végétales de l'université de Genève mais aussi de laboratoires externes à ce département. Parmi ces techniques je citerai en particulier la localisation de l'expression de gènes par hybridation in situ sur coupes paraffine en utilisant une méthode non radioactive et la comparaison au niveau tissulaire (microscopie photonique) et cellulaire (microscopie électronique à transmission) de divers phénotypes (voir Recherche). Elles ont également été mises à disposition d'étudiants en Master participant aux cours et stages pratiques d'Histochimie et de cytochimie" et "d'Introduction à la microscopie électronique" (voir Enseignement).

Microscopie Photonique

Dans ce domaine différentes techniques de préparation d'échantillons végétaux ont été utilisées en routine en vue de leur observation et de leur étude histologique et cytologique en microscopie photonique. Elles impliquent la réalisation de coupes dans des échantillons végétaux très divers (fleurs, tiges, racines, graines, siliques, nodules...). Les coupes ont été réalisées : (1)  dans du matériel frais à la lame de rasoir, ou  au microtome à main ou encore au vibratome; (2) dans des échantillons congelés, au microtome à congélation (cryostat) ou encore (3)  au microtome rotatif dans des échantillons fixés et inclus dans différents milieux: paraffine, Technovit 7100 ou encore dans différentes résines, epoxy (Epon, Spurr) et acryliques (LR White).
L'épaisseur des coupes obtenues varie selon la technique, de 100 microns (coupes main levée et vibratome) à 1 micron (coupes dans des résines). Les méthodes de fixation et d'inclusion varient bien sûr en fonction de l'objectif recherché.
Selon le type de coupes des protocoles de colorations et d'étude cellulaire ont été développés et sont utilisés en routine.

  • Colorations topographiques de routine: carmin - vert d'iode, hématoxyline, hémalun éosine, bleu de toluidine, safranine FAST green, safranine-bleu d'alcian, bleu astra fuchsine basique, jaune Napthtol, bleu de méthylène - fuchsine basique.
  • Colorations histochimiques de mise en évidence de divers constituants cellulaires : coloration de l'ADN (Feulgen, DAPI, Acridine Orange, Gomori), des polysaccharides (PAS, calcofluor, iodure de propidium), appliqués à des coupes paraffine et coloration de l'amidon (lugol) appliquée à des coupes fraîches.
  • Localisation d'activité peroxidasique sur coupes fraîches (vibratome) ou dans des organes entiers avec différents substrats: DAB (diaminobenzidine), TMB, chloronaphtol, syringaldazine.
  • Immunolocalisation sur coupes paraffine et coupes à congélation par immunofluorescence (FITC, rhodamine, AlexaFluor).
  • Localisation in situ d'activités enzymatiques sur coupes à congélation: peroxydases (différents substrats), déshydrogénases, phosphatases.
  • Expression de gènes par hybridation in situ sur coupes paraffine (méthode non radioactive, DIG, sondes ARN).
  • Localisation de l'expression GUS sur coupes Technovit.

Microscopes utilisés pour les observations et les prises de vue: Microscope photonique classique (Leica DMIRE2) et à fluorescence (Laborlux S, Leica DMIRE2, Nikon Eclipse 80i, caméras CCD)

Microscopie Confocale

- Détection in situ de Formes Activées de l'Oxygène dans des racines de plantules d' Arabidopsis en utilisant un indicateur fluorescent HPF (hydroxyphenyl fluorescein).
- Préparation de racines d'Arabidopsis selon la technique de coloration mPS-PI (pseudoschiff Propidium iodide) en vue de leur observation par microscopie confocale. La technique de coloration est parfaitement appropriée pour l'étude
de l'architecture cellulaire dans des extrémités de racines et des embryons d'Arabidopsis.
- Mise en évidence de fluorochromes comme le DAPI, le calcofluor (voir-ci dessus les colorations histochimiques).

Microscope : confocal Leica SP2 de la plateforme de bioimagerie de la faculté des sciences - Université de Genève

Microscopie électronique à Transmission

- Fixation chimique de divers tissus, organes végétaux et de fractions cellulaires et leur inclusion dans des résines (Epon, Spurr, LR White) en vue d'études cytologiques, d'observations utlrastructurales et d'immunolocalisations.
Ultramicrotomie: coupes ultrafines de 60 - 90 nm d'épaisseur (Ultramicrotomes Reichert OMU2, Leica Ultracut UCT).
- Réalisation de films support sur grilles (Formvar, Collodion).
- Colorations classiques de coupes ultrafines (plomb, acétate d' uranium).
- Explorations fonctionnelles : colorations cytochimiques: des polysaccharides (PATAg) et d' enzymes (peroxydase, phosphatase, ATPAse);  immumomarquage à l'or pour la localisation de pectines, peroxidases, protéines membranaires....
- Congélation d'extrémités de racines et de méristèmes de tige qui sont ensuite fracturés à basse t°  en vue de la réalisation d'une réplique de leur surface : Technique de cryofracture.
Des protocoles de préparation de divers échantilons végétaux ont été développés et sont mis à disposition (voir Protocoles).

Un préalable à la réalisation de coupes ultrafines s'avère le plus souvent indispensable: il s'agit de la réalisation de coupes de 1 μm d'épaisseur et de la coloration de ces coupes. Ce préalable a pour objectif de sélectionner au microscope photonique la partie de l'échantillon sur lequel on va se focaliser pour les observations au microscope électronique.

Microscopes utilisés pour les observations et les prises de vue: Philips EM410 (support photographique), FEI Technai G2 Sphera (acquisitions numériques) de la Plateforme de Bioimagerie - Faculté des Sciences - UniGE

Microscopie électronique à Balayage

Protocoles de préparation de divers types d'échantillons végétaux en vue de leur examen au microscope électronique à balayage.
Observations et prises de vue: avec le Microscope Jeol 6510 Lv de la plateforme de Bioimagerie de la Faculté des sciences de l'Université de Genève.

Microscopie à Force atomique

Le microscope à force atomique appartient à la famille des microscopes connus sous le nom de microscopes à champs proches ou microscopes à sonde locale. Ils permettent d'obtenir une image de la surface d'un échantillon, biologique ou non biologique, par balayage de cette dernière avec une pointe ou sonde. Le microscope à force atomique a permis d'obtenir des images topographiques de la surface de nombreux échantillons biologiques à sec mais surtout en conditions physiologiques avec une résolution spatiale élevée (latérale: 0,5 - 1nm; verticale : 0.1 nm en milieu liquide).

    Michèle Crèvecoeur
Microscopie des plantes

Email:
michele.crevecoeur@unige.ch

Dernière mise à jour :
16 juillet 2020

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